阿爾茨海默病果蠅模型中Aβ毒性的長度依賴性

韓萌馬萍麗1葉春艷2張保柱1章海燕2孫曉江黃福德3

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200233)

摘要〔〕目的探討阿爾茨海默病(AD)果蠅模型中β淀粉樣肽(Aβ)表達(dá)產(chǎn)生的毒性是否存在長度依賴性。方法利用GAL4/UAS系統(tǒng)，分別建立Aβ40、Aβ42、Aβ43轉(zhuǎn)基因AD果蠅模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將果蠅分為正常對(duì)照組、Aβ40組、 Aβ42組、Aβ43組，在整體動(dòng)物水平上進(jìn)行果蠅行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)各組果蠅的爬管能力和壽命。結(jié)果在果蠅爬管能力和生存時(shí)間的測(cè)試中，與對(duì)照組相比，AD轉(zhuǎn)基因果蠅均出現(xiàn)日齡依賴的運(yùn)動(dòng)能力下降及壽命明顯縮短，且Aβ片段長度較長的Aβ42、Aβ43轉(zhuǎn)基因果蠅的運(yùn)動(dòng)能力下降和壽命縮短更顯著。結(jié)論Aβ的毒性作用會(huì)導(dǎo)致AD轉(zhuǎn)基因果蠅的運(yùn)動(dòng)能力下降和壽命縮短，且Aβ片段長度越長，其毒性作用越重。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默?。晦D(zhuǎn)基因果蠅；β淀粉樣蛋白

中圖分類號(hào)〔〕R741.02〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371400)

通訊作者：孫曉江(1955-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腦血管病、癲癇等研究。

1中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所

2中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院藥物研究所

3中國科學(xué)院上海高等研究院干細(xì)胞與納米醫(yī)學(xué)中心

黃福德(1969-)，男，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究。

第一作者：韓萌(1987-)，女，在讀博士，主要從事阿爾茨海默病研究。

The toxicity of β-amyloid peptide depends on its length in transgenic Drosophila model of Alzheimer′s disease

HAN Meng, MA Ping-Li, YE Chun-Yan,etal.

Department of Neurology, Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200233, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the toxic effects of the β-amyloid (Aβ) peptide depends on its length in transgenic Drosophila model of Alzheimer′s disease (AD).MethodsUsing the classic GAL4/UAS system, three groups of transgenic flies expressing Aβ40(Aβ40 group), Aβ42(Aβ42 group) and Aβ43(Aβ43 group) were constructed in neurons respectively. The climbing assay and survival assay were performed on the three groups and control flies.ResultsCompared with control group, all Aβ-expressing flies showed enhanced age-dependent locomotor decline and shortened lifespan, with the order:control group>Aβ40 group>Aβ42 group>Aβ43 group.ConclusionsExpression of Aβin neurons produces toxicity in Drosophila and the toxicity is length-dependent, the longer the higher.

【Key words】Alzheimer′s disease; Transgenic Drosophila; β-amyloid peptides

阿爾茨海默病(AD)以老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、β-淀粉樣蛋白(Aβ)大量沉積以及神經(jīng)元缺失為主要病理特征〔1，2〕。AD的病因迄今不明，發(fā)病機(jī)制學(xué)說也有多種，目前研究較多的是Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說，認(rèn)為AD發(fā)病與Aβ蛋白的異常積累有密切關(guān)系〔3，4〕?，F(xiàn)在已建立了多種轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型，與其他動(dòng)物模型相比，果蠅模型具有基因高度保守且便于操控、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟、繁殖周期短、經(jīng)濟(jì)等特別的優(yōu)勢(shì)〔5〕。本研究應(yīng)用GAL4/UAS系統(tǒng)，在果蠅逃跑通路(GF)中分別表達(dá)不同長度的Aβ，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)基因果蠅和對(duì)照果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命是否受到損害，損害程度是否與Aβ的長度相關(guān)。

1材料與方法

1.1對(duì)象本研究所使用的果蠅均為黑腹果蠅，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為正常對(duì)照組、Aβ40組、Aβ42組、Aβ43組。在本實(shí)驗(yàn)中，果蠅在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在25℃，相對(duì)濕度70%，12 h晝夜循環(huán)光照。

1.2果蠅爬管能力實(shí)驗(yàn)材料美的加濕器，空調(diào)，果蠅管，改良的果蠅爬管能力檢測(cè)裝置(iRING)，索尼數(shù)碼相機(jī)，PC，果蠅爬管統(tǒng)計(jì)軟件。

1.3果蠅壽命測(cè)定材料果蠅培養(yǎng)基(蒸餾水、玉米粉、瓊脂、紅糖、酵母、丙酸、100%乙醇)，滅菌鍋，美的加濕器，空調(diào)，果蠅管，CO2麻醉盤，解剖鏡，羽毛筆，棉花，死蠅盛留器。

1.4建立轉(zhuǎn)基因AD果蠅模型合成帶有EcoRⅠ、XholⅠ酶切位點(diǎn)PCR引物，分別擴(kuò)增編碼果蠅necrotic基因分泌信號(hào)肽段“MASKVSILLLLTVHLLAAQTFAQ”與Aβ40、Aβ42或Aβ43多肽組成的融合蛋白的重組DNA，經(jīng)EcoRⅠ、XholⅠ酶切后鏈接到EcoRⅠ、XholⅠ酶切了的pUASattb質(zhì)粒、果蠅胚胎顯微注射，獲取定點(diǎn)插入的轉(zhuǎn)基因品系。分別與p〔Gal4〕A307果蠅交配，從而獲得在果蠅巨纖維通路分別等量表達(dá)含有Necrotic分泌信號(hào)肽的Aβ40、Aβ42或Aβ43融合蛋白的轉(zhuǎn)基因AD果蠅模型。

1.5果蠅爬管能力實(shí)驗(yàn)為了能夠大批量檢測(cè)果蠅的爬行能力，Gargano等〔6〕研制出“RING實(shí)驗(yàn)方法” 。我們通過改良，找到了更自動(dòng)、具有高度可重復(fù)性的，并且能夠定量分析的設(shè)備和方法。簡單來說，這個(gè)裝置包括一個(gè)矩形的金屬框架(32 cm×21 cm×6 cm)，框架內(nèi)可垂直的放置10個(gè)圓形透明的塑料管(半徑2.1 cm，高19.0 cm)；還包括可以垂直驅(qū)動(dòng)框架升降的電機(jī)，一次驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生4個(gè)來回的迅速升降，1次/min。每管10只果蠅，每次驅(qū)動(dòng)會(huì)使果蠅全部落入管底，果蠅由于習(xí)性會(huì)本能的向上爬，測(cè)試過程由錄像機(jī)記錄，后期應(yīng)用自主研制的軟件進(jìn)行分析。在此次實(shí)驗(yàn)中，每管果蠅測(cè)試5次，以停止敲擊后7 s為時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)果蠅的爬行高度，最后取平均值。統(tǒng)計(jì)3～5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果后比較各組間差異。

1.6果蠅壽命實(shí)驗(yàn)分別將雌雄各100只果蠅分別平均分到5個(gè)果蠅培養(yǎng)管中，每管中20只果蠅，做上標(biāo)簽待觀察。每3 d更換一次新鮮的培養(yǎng)基、食物及酵母量保持一致，同時(shí)記錄各組果蠅的死亡情況。

2結(jié)果

2.1AD轉(zhuǎn)基因果蠅品系的建立在本研究中，應(yīng)用GAL4/UAS激活系統(tǒng)使不同長度的人源Aβ蛋白在果蠅特定的組織特異性表達(dá)。主要使用了p〔Gal4〕A307驅(qū)動(dòng)Aβ在GF通路特異性表達(dá)。p〔Gal4〕A307的雌蠅處女蠅和攜帶不同長度的Aβ(Aβ40、Aβ42、Aβ43)轉(zhuǎn)基因的雄蠅雜交。雜交得到的子代作為實(shí)驗(yàn)果蠅。將果蠅分為4組：正常對(duì)照組含有一個(gè)拷貝的p〔Gal4〕A307轉(zhuǎn)基因；Aβ40組含一個(gè)拷貝的p〔Gal4〕A307 和 pUASattb-Aβ40；Aβ42含一個(gè)拷貝的p〔Gal4〕A307 和 pUASattb-Aβ42；Aβ43含有一個(gè)拷貝的p〔Gal4〕A307 和 pUASattb-Aβ43。

2.2果蠅爬管能力實(shí)驗(yàn)果蠅蛹化后7 d的攀爬能力均較好，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。而日齡21 d的果蠅爬管能力已經(jīng)出現(xiàn)了差異，除Aβ40組外，其余各組攀爬能力均較對(duì)照組明顯下降；且與Aβ42組比較，Aβ片段長度更長的Aβ43組果蠅的攀爬能力下降更顯著。果蠅日齡31 d時(shí)，與對(duì)照組相比，Aβ轉(zhuǎn)基因品系的果蠅爬管能力急劇下降；且各組之間比較顯示，Aβ40組果蠅的爬管能力減弱最輕，Aβ42組果蠅爬管能力下降加劇，與Aβ43組相當(dāng)。見表1。

組別7d21d31d正常對(duì)照組15.20±0.08410.97±0.878.56±0.16Aβ40組14.69±1.1210.11±1.096.81±0.951)Aβ42組14.76±1.527.73±1.061)2)4.75±0.871)2)Aβ43組15.11±0.995.777±0.541)2)3)3.90±0.811)2)

與正常對(duì)照組相比：1)P<0.05;與Aβ40組相比：2)P<0.05;與Aβ42組相比：3)P<0.05

2.3果蠅壽命實(shí)驗(yàn)與正常對(duì)照組(44 d)相比，各組Aβ轉(zhuǎn)基因果蠅的平均壽命明顯縮短(P<0.05)。Aβ40組(43 d)與Aβ42組(41 d)比較，Aβ42組生存時(shí)間更短(P<0.05)，而Aβ片段長度更長的Aβ43組(39 d)果蠅的壽命比Aβ40和Aβ42組壽命縮短更顯著(P<0.05)。

3討論

近年來，AD的發(fā)病機(jī)制研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。人們逐漸認(rèn)識(shí)到AD病人大腦皮層、海馬區(qū)有大量的淀粉樣斑塊(又稱老年斑)和神經(jīng)纖維纏結(jié)是其主要病理特征。后續(xù)Glenner、Masters等〔7，8〕發(fā)現(xiàn)，Aβ是老年斑的主要成分。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過β泌肽酶和γ泌肽酶的蛋白裂解過程產(chǎn)生的，由于剪切位置或結(jié)構(gòu)不同而得到不同長度的Aβ(如Aβ40、Aβ42、Aβ43和Aβ45等〔9，10〕)。這些Aβ單體經(jīng)過結(jié)構(gòu)折疊并聚集形成寡聚體。目前，Aβ蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，在許多毒性因子中，最主要的是寡聚體〔11～13〕。而由于不同長度的Aβ具有不同的折疊和聚集特性，導(dǎo)致其神經(jīng)毒性也是不同的。

據(jù)報(bào)道〔14〕，p〔Gal4〕A307可驅(qū)動(dòng)基因在果蠅GF特異性表達(dá)；而且，在果蠅GF系統(tǒng)中表達(dá)野生型或者突變型Aβ42可導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)Aβ42積累顯著增多、日齡依賴的突觸功能障礙、運(yùn)動(dòng)能力損害以及果蠅壽命明顯縮短〔15～17〕，可用于構(gòu)建AD果蠅模型。本研究結(jié)果顯示，Aβ導(dǎo)致的果蠅運(yùn)動(dòng)能力損害具有日齡依賴性，且不同長度Aβ引起的損害程度是不同的。提示可能Aβ42比Aβ40聚集性強(qiáng)，Aβ43又比Aβ42更強(qiáng)，其導(dǎo)致的神經(jīng)毒性更重。這與之前國內(nèi)外其他體外研究〔18～20〕結(jié)果一致。

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〔2014-03-11修回〕

(編輯徐杰)