四逆散及其拆方對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠SOCS1·STAT6活性的影響

趙令竹,曲道煒,林庶茹,盧健*,張宏邈

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

摘要：目的從IL-4/STAT6信號(hào)通路入手，以該通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SOCS1和關(guān)鍵因子STAT6為檢測(cè)指標(biāo)，多角度探查潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與IL-4的關(guān)系。方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組,采用免疫法造模，用免疫組化法檢測(cè)大鼠SOCS1、STAT6的活性。結(jié)果模型組實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性(0.485 5±0.178 0)顯著低于正常組(0.655 2±0.187 4)，P<0.05；而STAT6 活性(0.803 0±0.208 2)則明顯高于正常組(0.589 3±0.191 9)，P<0.05。四逆散能顯著增加實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性(0.576 5±0.208 0)(P<0.05),降低STAT6活性(0.579 8±0.152 6)(P<0.05)；柴芍配伍(0.562 5±0.275 7)對(duì)SOCS1活性的影響與四逆散(0.576 5±0.208 0)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)STAT6活性(0.529 4±0.144 3)表達(dá)的影響顯著優(yōu)于四逆散(0.579 8±0.152 6)(P<0.05);芍枳甘配伍(0.616 9±0.200 6)對(duì)STAT6活性的影響作用明顯,與四逆散(0.579 8±0.152 6)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；柴枳甘配伍對(duì)SOCS1(0.509 1±0.227 9)、STAT6(0.756 1±0.263 6)的影響與模型組(0.485 5±0.178 0；0.803 0±0.208 2)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論四逆散能夠通過刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表達(dá)來調(diào)節(jié)IL-4/STAT6通路，進(jìn)而干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎。其中，柴芍配伍作用明顯;芍枳甘配伍對(duì)STAT6活性的影響作用明顯，但對(duì)SOCS1的影響不顯著；柴枳甘配伍對(duì)SOCS1、STAT6的影響均不顯著。

關(guān)鍵詞：四逆散；SOCS1；STAT6；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.026

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)10-1056-04

基金項(xiàng)目:教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類資助課題(20122133120009)。

作者簡介:趙令竹(1975-)，女，博士研究生，講師，主要從事《傷寒論》經(jīng)典方劑的現(xiàn)代研究與應(yīng)用。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2015-01-06)

*通信作者:盧健,電話-15242007553,電子信箱-juioo@sina.com

Sini powders and different compatibilities influence on SOCS1·STAT6 in

experimental ulcerative colitis rats

ZHAO Lingzhu,QU Daowei,LIN Shuru,LU Jian*,ZHANG Hongmiao

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relation with IL-4 and UC through multi angles,starting with the IL-4/STAT6 pathway.MethodsThe experimental animals were divided into 6 groups.We made the model in immune method,detected activity of SOCS1 and STAT6 in rats with immune.ResultsThe activity SOCS1 in model group of rats (0.485 5±0.178 0) were significantly lower than that of normal group (0.655 2±0.187 4)(P<0.05),but the activity of STAT6(0.803 0±0.208 2) were significantly higher than that in the normal group (0.589 3±0.191 9) (P<0.05).Sinisan Powders can significantly increase the activity of SOCS1 (0.576 5±0.208 0) in experimental rats (P<0.05),decrease STAT6 activity (0.579 8±0.152 6) (P<0.05).The effects of Chaishao compatibility (0.562 5±0.275 7) was no significant difference with SOCS1 and Sinisan (0.576 5±0.208 0) Powders (P>0.05),the activity of STAT6 (0.529 4±0.144 3) was significantly better than the Sinisan (0.579 8±0.152 6) Powders (P<0.05).Shaozhigan compatibility effects on activity of STAT6 (0.616 9±0.200 6) significantly.Chaizhigan compatibility had no significant difference with SOCS1 (0.509 1±0.227 9),STAT6(0.756 1±0.263 6) and the model group (0.485 5±0.178 0;0.803 0±0.208 2) in effects (P>0.05).ConclusionSinisan Powders can regulate expression of the IL-4/STAT6 pathway by stimulating the activity of SOCS1,inhibiting the activity of STAT6,then intervention experiment UC.And the effect of Chaishao compatibility was the best obvious;the effects of Shaozhigan compatibility was obvious on activity of STAT6,but not on SOCS1.The effect of Chaizhigan compatibility were not obvious on SOCS1 and STAT6.

Keywords:Sini powers;SOCS1;STAT6;ulcerative colitis;rat

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)為臨床常見病、難治病。大量臨床研究與實(shí)驗(yàn)研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病與細(xì)胞因子密切相關(guān)。有研究表明，IL-4作為抗炎因子,參與了潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥過程。本課題組成員，在前期工作中已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)與IL-4相關(guān)，其可以通過NF-κB相關(guān)通路加以調(diào)控[1-2]。為進(jìn)一步探討潰瘍性結(jié)腸炎與IL-4的關(guān)系，本研究從IL-4/STAT6信號(hào)通路入手，以該通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SOCS1和關(guān)鍵因子STAT6為檢測(cè)指標(biāo),多角度探查潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與IL-4的關(guān)系，為研究中藥多途徑發(fā)揮作用提供思路。

1實(shí)驗(yàn)材料

四逆散由柴胡、芍藥、枳實(shí)、甘草以1∶1∶1∶1比例組成。柴胡免煎顆粒(1312079)、芍藥免煎顆粒(1312028)、枳實(shí)免煎顆粒(1312168)、甘草免煎顆粒(1312100)均購自江蘇省江陰天江藥業(yè)有限公司；固腸止瀉丸購自沈陽市東北大藥房，批號(hào)：132440，由西安阿房宮藥業(yè)有限公司提供。上述藥物按臨床成人用量的6.3倍折算實(shí)驗(yàn)大鼠的用量。SD大鼠(SPF級(jí)，SCXK(遼)2010-0001)60只,雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，分別為:正常組、模型組、四逆散組、柴枳甘組、芍枳甘組、柴芍組。每組10只，各組體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無顯著差異?？贵w(BA1110)、DAB顯色試劑盒(AR1322),均購自武漢博士德生物工程有限公司。ASP300脫水機(jī)，德國徠卡儀器有限公司；SAKURA包埋機(jī)，日本櫻花會(huì)社;Leica(H11210)烤片機(jī)，德國徠卡儀器有限公司；DH-GZX電熱恒溫干燥箱，中國廈門醫(yī)療電子儀器廠；濕盒(ZLI-9322),北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；OLYMPUS顯微鏡(BX-51)，TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社(日本)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1免疫法造模[3]應(yīng)用新鮮家兔結(jié)腸黏膜配制抗原乳化液,按1 mL/100 g體質(zhì)量的濃度分別配制灌胃藥物。于造模第1天分別于實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)足跖、腹股溝及背部注射抗原乳化液約0.5 mL/只；第7、14、21天依同法注射；造模第2天開始分組灌胃。每天觀察大鼠狀態(tài)及飲食、飲水情況；每周測(cè)1次體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第24天灌胃后2 h，稱重，麻醉，腹主動(dòng)脈取血；然后全部處死，自肛門2 cm上約8 cm處剖取結(jié)腸，剖開、展平結(jié)腸，觀察黏膜，并以多聚甲醛固定，做病理切片，鏡下觀察。

2.2結(jié)腸組織病理切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

2.3大鼠結(jié)腸黏膜SOCS1、STAT6免疫組化的測(cè)定采用免疫組化法(SP)，按常規(guī)步驟進(jìn)行。SOCS1、STAT6陽性細(xì)胞染色均定位于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)中呈棕黃或更深的棕褐色的細(xì)小顆粒為陽性細(xì)胞。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以平均光密度反應(yīng)SOCS1、STAT6細(xì)胞活性。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠一般狀況的影響造模第l4天，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)食量減少、拱背、聚堆、懶動(dòng)現(xiàn)象。造模第22天，模型組大鼠均出現(xiàn)飲食明顯減少，稀便、毛發(fā)不澤，拱背、聚堆、懶動(dòng)，各藥物組大鼠上述癥狀有不同程度改善。

3.2結(jié)腸組織病理學(xué)模型組大鼠病變結(jié)腸黏膜表面可見潰瘍，個(gè)別深達(dá)肌層，炎癥反應(yīng)較重，有充血、糜爛，中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜上皮部分缺失，局部固有層腺體減少，黏膜下層血管增生，黏膜肌層不明顯(圖1)。其余各組均有不同程度的病變。

圖1　實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織病理切片(Colon HE×100)

3.3對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1、STAT6蛋白活性的影響

3.3.1對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠SOCS1蛋白活性的影響(圖2)與正常組比較,模型組及各給藥組實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，四逆散組和柴芍組各實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性均明顯升高(P<0.05)；與四逆散組比較，柴芍組無顯著性差異(P>0.05)，柴枳甘組與芍枳甘組實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性明顯均顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖2　實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織SOCS1免疫組化圖片(Colon HE×40)

3.3.2對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠STAT6蛋白活性的影響(圖3)與正常組比較，模型組實(shí)驗(yàn)大鼠STAT6活性明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，四逆散組、芍枳甘組與柴芍組實(shí)驗(yàn)大鼠STAT6活性顯著降低(P<0.05)；與四逆散組比較，芍枳甘組實(shí)驗(yàn)大鼠STAT6活性無顯著性差異(P>0.05)，柴枳甘組明顯增高(P<0.05),而柴芍組則顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖3　實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織STAT6免疫組化圖片(Colon HE×40)

組 別結(jié)腸組織SOCS1平均光密度結(jié)腸組織STAT6平均光密度正常組 0.6552±0.1874 0.5893±0.1919 模型組 0.4855±0.1780# 0.8030±0.2082# 四逆散組0.5765±0.2080#△0.5798±0.1526△ 柴枳甘組0.5091±0.2279#▲0.7561±0.2636#▲ 芍枳甘組0.4824±0.1387#▲0.6169±0.2006△ 柴芍組 0.5625±0.2757#△0.5294±0.1443#△▲

注：與正常組比較,#P<0.05；與模型組比較,△P<0.05；與四逆散組比較,▲P<0.05

4討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥，中醫(yī)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎總屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以脾腎虧虛，陰陽氣血虧虛為主，標(biāo)實(shí)以濕熱毒邪蘊(yùn)結(jié)，氣血阻滯，兼有肝郁，肺氣失宣等[4],辨證治療潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的優(yōu)勢(shì)及鮮明的特色[5]，如以柴胡芍藥湯為主方辨證治療潰瘍性結(jié)腸炎，療效顯著[6]。中醫(yī)中藥通過何種途徑、如何發(fā)揮療效也成為晚近研究的熱點(diǎn)。

大量研究表明[7-10],潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)與IL-4密切相關(guān)。IL-4主要通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activator of transcription,STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及表達(dá)細(xì)胞信號(hào)抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)對(duì)Th細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)。

IL-4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要與JAK/STAT途徑有關(guān)。JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑是近幾年新發(fā)現(xiàn)的從分子水平調(diào)控細(xì)胞因子生物學(xué)功能的重要途徑之一。一種細(xì)胞因子的信號(hào)通路可以激活多個(gè)JAK激酶，但對(duì)激活的STAT分子卻具有一定的選擇性，IL-4能選擇性地激活STAT6,促炎反應(yīng)的發(fā)生可能是IL-4/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)所致[11]。IL-4通過SOCSI蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)的產(chǎn)生和衰減[12]。IL-4/STAT6的信號(hào)可使Th2表達(dá)SOCS1，而SOCS1的過表達(dá)則主要抑制IL-4所誘導(dǎo)的STAT6[13]。SOCS是細(xì)胞因子激活的JAK/STAT信號(hào)通路必需的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)于啟動(dòng)炎癥反應(yīng)非常重要[14]。STAT是最能代表JAK底物的底物之一[15]，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活上發(fā)揮關(guān)鍵性作用。STAT6作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)IL-4的反應(yīng)[16]，在炎癥、自身免疫和變態(tài)反應(yīng)性疾病中起重要作用,近年的研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織STAT6水平升高[17]。

由表1可以看出，模型組實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1 活性顯著低于正常組(P<0.05),而STAT6活性則明顯高于正常組(P<0.05)。灌服四逆散后，實(shí)驗(yàn)大鼠SOCS1活性顯著增加(P<0.05)，而STAT6活性則顯著降低(P<0.05)，說明四逆散能夠通過刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表達(dá)來調(diào)節(jié)IL-4/STAT6通路，進(jìn)而干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎。

從3個(gè)拆方組可以看出，柴芍配伍對(duì)SOCS1活性的影響與四逆散無顯著性差異(P>0.05)，但對(duì)STAT6活性表達(dá)的影響顯著優(yōu)于四逆散(P<0.05)；芍枳甘配伍對(duì)STAT6活性的影響作用明顯，與四逆散比較無顯著性差異(P>0.05)，但對(duì)SOCS1的影響不明顯；柴枳甘配伍對(duì)SOCS1、STAT6的影響均不顯著，與模型組無顯著性差異(P>0.05)。

綜上分析，四逆散能夠通過調(diào)節(jié)SOCS1、STAT6 活性的表達(dá)來影響IL-4/STAT6通路，干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎。方中柴芍配伍作用明顯；四逆散去除柴胡后,對(duì)STAT6活性的影響作用明顯；而四逆散去除白芍后，對(duì)SOCS1、STAT6的影響均不明顯。

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