結(jié)腸癌組織中NDRG1及TGF-β1的表達(dá)及意義

曹翌1，彭春輝1，楊開(kāi)1，張小薄2

(1錦州石化醫(yī)院，遼寧錦州121000；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院)

摘要：目的觀察結(jié)腸癌組織中NDRG1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)變化，探討其臨床意義。方法選取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本各78例，采用免疫組化法檢測(cè)其N(xiāo)DRG1、TGF-β1蛋白表達(dá)；切取新鮮結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織16例，采用qRT-PCR法及Western blotting法檢測(cè)其N(xiāo)DRG1、TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P均<0.05)。NDRG1及TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度和Dukes分期有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)腸癌組織中NDRG1與TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.231，P<0.05)。結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織(P均<0.05)。結(jié)論 NDRG1及TGF-β1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，提示結(jié)腸癌預(yù)后不良，二者可能對(duì)結(jié)腸癌的惡性行為具有調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸腫瘤；NDRG1基因；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.034

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2015)41-0081-04

收稿日期：(2015-07-06) (2015-04-10)

結(jié)腸癌發(fā)病為多基因、多因素共同作用的結(jié)果[1]。NDRG1屬NDRG家族成員,目前其作用存在抑癌及促癌兩種不同觀點(diǎn)，有研究認(rèn)為其在不同組織來(lái)源、不同分化程度及腫瘤的不同階段對(duì)腫瘤惡性行為作用不同[2]。有研究認(rèn)為，NDRG家族可能通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的分化、增殖及凋亡等惡性行為發(fā)揮作用[3]。本研究對(duì)結(jié)腸癌組織中NDRG1及TGF-β1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，探討NDRG1及TGF-β1在結(jié)腸癌惡性行為中的作用及對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

通信作者：曹翌

1材料與方法

1.1材料選取2013年1月~2014年7月于錦州石化醫(yī)院及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的結(jié)腸癌及其癌旁正常組織標(biāo)本各78例，石蠟包埋；在手術(shù)標(biāo)本移除后切取少量新鮮直徑0.5 cm結(jié)腸癌及癌旁正常組織16例，置于液氮中冷凍保存。鼠NDRG1多克隆抗體及兔TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，SP免疫組化試劑盒、miRNA提取分離試劑盒、TRIzol及Lipofectamine 2000購(gòu)自日本Takara公司。引物由大連寶生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，NDRG1上游引物：5′-CCTCUCATACGCGCGGAC-3′，下游引物：5′-CGCGGACCTAGUUGATCG-3′；TGF-β1上游引物：5′-CCAGGCUCGTTCTAGATGCUC-3′，下游引物：5′-CCGCUTCCTAGGAGACACCG-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGCCUAGCTCACAUCCGCG-3′，下游引物：5′-CUCGTCTCGAGTAGUCTGC-3′。

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1.2結(jié)腸癌組織及癌旁組織中NDRG1、TGF-β1表達(dá)檢測(cè)

1.2.1NDRG1、TGF-β1蛋白定性檢測(cè)采用免疫組化法。以已知小腸組織中NDRG1和TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。石蠟塊切片(4 μm厚)，60 ℃烤箱中烘烤2 h后進(jìn)行脫水、脫蠟、抗原修復(fù)，3% H2O250 mL洗滌后37 ℃烤箱內(nèi)烘干25 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次。加1∶500稀釋一抗置入濕盒中4 ℃下孵育過(guò)夜。室溫復(fù)溫20 min，PBS再洗滌3次，加入二抗37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染10 min、流水洗凈后鹽酸乙醇分化20 s，再次沖洗30 min，脫水透明，二甲苯中性樹(shù)膠封片。由2位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估結(jié)果。400倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分比<10%計(jì)0分，10%～24%計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～74%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，黃或深黃色計(jì)2分，褐或棕褐色計(jì)3分；二者相加>2分即為表達(dá)陽(yáng)性。

1.2.2NDRG1、TGF-β1蛋白半定量檢測(cè)采用Western blotting法。取新鮮組織標(biāo)本約100 mg，加500 μL蛋白裂解液后剪碎，冰上靜置30 min,4 ℃、12 000 g離心30 min，BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，樣品均定量為6 g/L，每條泳道上樣蛋白量為50 μg，采用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠在電壓70 V條件下進(jìn)行80 min電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗，4 ℃溫度下孵育過(guò)夜，TBST洗膜、加入二抗、室溫下孵育2 h，TBST清洗，ECL發(fā)光同時(shí)進(jìn)行凝膠顯像儀顯像后采用Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.3NDRG1、TGF-β1mRNA檢測(cè)采用qRT-PCR法。剪取新鮮結(jié)腸癌及癌旁組織標(biāo)本約100 mg，進(jìn)行液氮物理研磨，按TRIzol步驟進(jìn)行細(xì)胞株總RNA的分離、純化，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系：SYBR Green 12.5 μL、DEPC-treated water 8.5 μL、cDNA模板2.0 μL、10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL，總體積25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性5 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)復(fù)孔，GAPDH作為內(nèi)參照，△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。NDRG1與TGF-β1的相關(guān)性采用Spearman-rank相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1結(jié)腸癌組織及癌旁組織中NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.95%(53/78)、73.08%(57/78)，癌旁組織中分別為21.79%(17/78)、34.62%(27/78)，結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P均<0.05)。

2.2結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1的蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、病理分型、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，而與腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和Dukes分期有關(guān)(P均<0.05),見(jiàn)表1。

2.3結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性Spearman rank相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中NDRG1與TGF-β1的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.231，P<0.05)。

2.4結(jié)腸癌組織及癌旁組織中NDRG1、TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量結(jié)腸癌組織中NDRG1蛋白、TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量0.864±0.219、0.769±0.425，癌旁組織中分別為0.323±0.104、0.317±0.154，結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1蛋白表達(dá)量高于癌旁組織(P均<0.05)。

2.5結(jié)腸癌組織及癌旁組織中NDRG1、TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量結(jié)腸癌組織中NDRG1與TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.367±0.281、1.379±0.326，癌旁組織分別為0.663±0.183、0.538±0.217，結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織(P均<0.05)。

表1　結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β 1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率以每年3%～10%速度增長(zhǎng)，死亡率居我國(guó)惡性腫瘤第5位，浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌死亡的主要原因[4]。手術(shù)切除是結(jié)腸癌治療的主要手段，早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷是提高結(jié)腸癌根治性手術(shù)切除率及生存期的基礎(chǔ)，對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)基因的篩查及治療靶點(diǎn)的選擇是目前研究的方向。

NDRG1在不同惡性腫瘤細(xì)胞及不同種族人群表達(dá)水平有區(qū)別[5]，在腫瘤發(fā)展的不同階段表達(dá)水平也不同。有研究結(jié)果顯示，在肺癌A549細(xì)胞NDRG1過(guò)表達(dá)會(huì)逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)A549細(xì)胞Snail表達(dá)的誘導(dǎo)作用。TGF-β1通過(guò)Smad信號(hào)通路調(diào)控Snail表達(dá)，促進(jìn)p-Smad、p-AKT磷酸化。但是，過(guò)表達(dá)NDRG1明顯抑制AKT磷酸化，但對(duì)Smad磷酸化卻無(wú)影響，可見(jiàn)NDRG1只參與TGF-β1對(duì)AKT的調(diào)控，從而抑制Snail表達(dá)。NDRG1對(duì)AKT的抑制可能與NDRGl調(diào)控PTEN表達(dá)相關(guān)[6]。研究結(jié)果顯示，NDRG1與胰腺癌的惡性行為呈正相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)提示胰腺癌的不良預(yù)后[7]。在肝細(xì)胞癌中，NDRG1可能通過(guò)AKT信號(hào)通路調(diào)控TGF-β1表達(dá)，從而促進(jìn)惡性腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)形成[8]。在Ⅰ、Ⅱ期宮頸腺癌組織中NDRG1高表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生、發(fā)展，從而縮短患者的生存時(shí)間，并提示愈后不良[9]。NDRG1 mRNA和蛋白在中等分化胰腺癌細(xì)胞Capan-1中因缺氧上調(diào)，在分化差的Panc-1細(xì)胞系中無(wú)變化，NDRG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞分化程度具有標(biāo)志物作用。但也有研究結(jié)果與其相反，可能在不同分化階段及缺氧程度不同的條件下，NDRG1表現(xiàn)為抑癌及促癌雙重作用[10]。TGF-β1可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。TGF-β1信號(hào)通路活化與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),在不同條件下也表現(xiàn)出促癌或抑癌雙重作用。在正常上皮細(xì)胞中，TGF-β1通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子而抑制細(xì)胞增殖；而在結(jié)腸癌細(xì)胞，TGF-β1會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)，自抑癌向促癌活性轉(zhuǎn)變[12]。TGF-β1在結(jié)腸癌HaCaT細(xì)胞中從轉(zhuǎn)錄水平即直接激活NDRG1表達(dá)，并通過(guò)Smad2、Smad3及Smad4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性激活NDRG1轉(zhuǎn)錄，Sp1過(guò)表達(dá)會(huì)進(jìn)一步提高TGF-β1誘導(dǎo)NDRG1啟動(dòng)子活性[13]。NDRG1高表達(dá)與胰腺癌微血管密度升高具有相關(guān)性，進(jìn)一步提示其促癌活性。多種原因可誘導(dǎo)TGF-β1功能改變,多種因素誘發(fā)TGF-β1增殖抑制通路突變失活是主要原因,在結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1缺陷修復(fù)通路不能有效激活以抑制基因缺陷信號(hào)通路,使其自抑癌基因向促癌基因轉(zhuǎn)變[14]。

本研究結(jié)果顯示，NDRG1及TGF-β1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)高于癌旁組織。NDRG1及TGF-β1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、病理分型、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，而與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度和Dukes分期有關(guān)；NDRG1及TGF-β1表達(dá)水平升高提示結(jié)腸癌的惡性行為。有研究認(rèn)為，分化的細(xì)胞處于缺氧環(huán)境中可表達(dá)NDRG1，NDRG1能抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，但隨著缺氧加重，NDRG1可能對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用。本研究的病理組織均為進(jìn)展期結(jié)腸癌，而以往的研究多為結(jié)腸癌離體細(xì)胞水平，腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境及細(xì)胞的生長(zhǎng)階段不同，NDRG1表達(dá)的生物學(xué)特征也有差異[15]。本研究結(jié)果提示，結(jié)腸癌組織中NDRG1與TGF-β1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)性，二者可能在結(jié)腸癌病理學(xué)特征中具有協(xié)同作用；分子生物學(xué)研究結(jié)果也顯示，NDRG1在結(jié)腸癌演變過(guò)程中在表觀遺傳學(xué)方面的改變會(huì)對(duì)TGF-β1的功能具有調(diào)節(jié)作用，NDRG1會(huì)通過(guò)與靶基因3′端非翻譯區(qū)不完全配對(duì)，以抑制靶基因mRNA翻譯或降解,從而參與細(xì)胞分化、增殖、發(fā)育及代謝的生物過(guò)程。NDRG1可能參與TGF-β1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中NDRG1、TGF-β1在蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)高于癌旁正常組織，這與免疫組化結(jié)果一致，提示在mRNA水平即以發(fā)生NDRG1及TGF-β1的調(diào)控。

綜上所述，NDRG1及TGF-β1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，二者的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理指標(biāo)具有相關(guān)性，提示直腸癌的惡性行為及不良預(yù)后，可作為結(jié)腸癌預(yù)后的標(biāo)志物，是進(jìn)一步基因治療的靶點(diǎn)之一。

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