·基礎(chǔ)研究·

NF-κB對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈組織前列環(huán)素表達(dá)的影響

伊金萍1，于曉曉2，董孟2，楊杰2

(1汶上縣人民醫(yī)院，山東汶上272500；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

摘要：目的觀察核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)對(duì)肺動(dòng)脈高壓(PH)大鼠肺動(dòng)脈組織前列環(huán)素(PGI2)表達(dá)的影響。方法將50只大鼠隨機(jī)分為4組，Tn、Ti組各15只，均通過頸總動(dòng)脈—頸外靜脈吻合建立左向右分流型PH模型，Ti組術(shù)前1 h腹腔注射NF-κB阻斷劑吡咯烷二硫基甲酸鹽(PDCT)120 mg/(kg·d)，術(shù)后持續(xù)2周； Co組10只除不給予頸總動(dòng)脈—頸外靜脈吻合外其余造模過程與Tn、Ti組相同， Cn組10只不處理。各組連續(xù)飼養(yǎng)12周后，采用心導(dǎo)管術(shù)測(cè)量右心室收縮壓代表肺動(dòng)脈收縮壓(PASP)，通過凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性,以免疫組化法檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中的PGI2。結(jié)果Tn組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性高于Cn組(P<0.01)，Ti組NF-κB活性低于Cn組(P<0.01)，而Co組與Cn組比較無(wú)明顯差異。Tn組大肺動(dòng)脈組織PGI2表達(dá)量較Cn組明顯減少(P<0.01)，Ti組與Cn組、Co組與Cn組比較均無(wú)明顯差異。結(jié)論 PH大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性增加，可抑制血管活性物質(zhì)PGI2的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：肺動(dòng)脈高壓；前列環(huán)素；核轉(zhuǎn)錄因子κB；血管內(nèi)皮細(xì)胞；肺血管重建

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.008

中圖分類號(hào)：R725.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(Z2008C14)。

收稿日期：(2015-05-01)

通信作者：楊杰

兒童左向右分流先天性心臟病常導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓(PH)，肺血管重建是PH的重要發(fā)病機(jī)制[1]。肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管收縮和舒張物質(zhì)在肺血管功能中起重要作用，舒張因子前列環(huán)素(PGI2)可抑制平滑肌細(xì)胞增殖。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)激活通路存在于血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞，已證實(shí)高肺血流所致的大鼠肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重建與NF-κB活性增強(qiáng)有關(guān)[2]。2014年1～10月，我們觀察了NF-κB對(duì)PH大鼠肺動(dòng)脈組織PGI2表達(dá)的影響，為PH的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料4周齡Wistar雄性大鼠50只(購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量平均120 g；核蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Active Motif公司，地高辛標(biāo)記的NF-κB試劑盒購(gòu)自羅氏公司，PGI2免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自輝瑞公司，NF-κB阻斷劑吡咯烷二硫基甲酸鹽(PDCT)購(gòu)自南京德寶生化器材有限公司，PHLIPS-V24E監(jiān)護(hù)儀購(gòu)自飛利浦公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模處理將50只大鼠隨機(jī)分為4組，Tn、Ti組各15只，均通過頸總動(dòng)脈—頸外靜脈吻合建立左向右分流型PH模型，Ti組術(shù)前1 h腹腔注射PDCT 120 mg/(kg·d)，術(shù)后持續(xù)2周； Co組10只除不給予頸總動(dòng)脈—頸外靜脈吻合外其余造模過程與Tn、Ti組相同， Cn組10只不處理。各組連續(xù)飼養(yǎng)12周。

1.2.2肺動(dòng)脈壓測(cè)量各組用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉大鼠，透視下以3 F右心導(dǎo)管經(jīng)大鼠右側(cè)頸外靜脈到右心室，通過壓力傳感器通道，記錄右心室收縮壓，理論上等于肺動(dòng)脈收縮壓(PASP)。

1.2.3肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性觀察脫頸處死大鼠，分離肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞并培養(yǎng)；提取內(nèi)皮細(xì)胞核蛋白，制備DNA探針，行凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(ESMA試驗(yàn)，美國(guó)羅氏公司地高辛標(biāo)記的NF-κB試劑盒)，按試劑盒說明操作，以光密度值(OD)表示NF-κB活性；該值越大，NF-κB活性越高。

1.2.4肺動(dòng)脈組織PGI2檢測(cè)切取肺動(dòng)脈組織后應(yīng)用生理鹽水沖洗組織去除血漬，之后迅速應(yīng)用組織細(xì)胞固定液按照20∶1比例固定組織。經(jīng)過沖洗、脫水、硬化、透明、滲透、包埋等過程后，應(yīng)用切片機(jī)制作組織切片。采用免疫組化法檢測(cè)肺動(dòng)脈組織PGI2，按試劑盒說明書操作，獲取圖像后用計(jì)算機(jī)圖像分析其 OD值，以此表示PGI2表達(dá)量。

2結(jié)果

分流手術(shù)中，Tn、Ti組各死亡1只；觀察期，Tn、Ti、Co組各死亡1只，Ti組分流不通而被排除1只。各組PASP、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性、肺動(dòng)脈組織PGI2表達(dá)比較見表1。

表1　 各組PASP、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性、

注：與Tn組比較，*P<0.01；與Ti組比較，#P<0.01。

3討論

正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管收縮和舒張物質(zhì)處于平衡狀態(tài)，以維持肺動(dòng)脈低張力、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和血管損傷修復(fù)功能，這種平衡受損會(huì)改變肺動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和抗張力特性，從而造成血管重建，導(dǎo)致PH[3，4]。體外研究已經(jīng)證明，高肺血流可引起切應(yīng)力增加，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮釋放促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的血管活性物質(zhì)合成和分泌增加，如內(nèi)皮素(ET)、血管緊張素(AngⅡ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和血管活性肽等[5，6]，而使抑制平滑肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子合成和分泌減少，如PGI2、心鈉素(ANP)、腎上腺髓質(zhì)素、一氧化氮、一氧化碳、硫化氫等[7～9]。

體內(nèi)外研究顯示，許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在血管內(nèi)膜的形成中起重要作用。NF-κB家族成員在控制血管基因表達(dá)中起重要作用。NF-κB可通過一些炎性介質(zhì)來(lái)干預(yù)NO、ET-1、VEGF、FGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響肺血管重建[10，11]。NF-κB不僅在炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中起重要的調(diào)節(jié)作用，并參與肺血管重建、肺動(dòng)脈對(duì)刺激因子的收縮反應(yīng)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡等過程。血管活性物質(zhì)PGI2存在于多種組織和器官中，包括腎上腺、心臟、肺臟、腎臟及血管等，主要由血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞合成和分泌[12，13]。PGI2在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)由精氨基琥珀酸經(jīng)過環(huán)氧化酶合成，具有舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和抗血小板聚集的作用，能防止各種因素所導(dǎo)致的肺血管收縮和重建[14]。本研究結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活性增加，可抑制血管活性物質(zhì)PGI2的表達(dá)。我們推測(cè)，高血流剪切力作用于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，可激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，抑制血管活性物質(zhì)PGI2合成及分泌，肺動(dòng)脈收縮和肺血管重建，導(dǎo)致PH發(fā)生。未來(lái)先天性心臟病PH的治療方向之一是明確治療靶點(diǎn)，本研究為此類PH的預(yù)防和靶向性治療提供了新的依據(jù)和方法。

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