高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定霉酚酸酯及霉酚酸的血藥濃度

朱順海1*趙夢(mèng)蕓2陳佳2許志良1**

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053；2.中科（杭州）生命科學(xué)院有限公司 杭州 310052)

摘 要目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人體血漿中霉酚酸酯及霉酚酸的藥物濃度。方法：血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）的色譜柱，流動(dòng)相為0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 5.3）-乙腈（50∶50）。檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，柱溫 35 ℃，流速 1.0 ml/min。結(jié)果：本方法測(cè)定的線性范圍為0.25 ~20 mg/ml，r(霉酚酸)=0.999 76，r(霉酚酸酯)=0.999 99。霉酚酸和霉酚酸酯的加標(biāo)回收率分別為（87.38±2.97）%和（99.71±1.18）%，最低檢出限分別為0.035 mg/ml和0.070 mg/ml（S/N=3）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單，靈敏，重現(xiàn)性好，適合器官移植等患者霉酚酸及霉酚酸酯的血藥濃度監(jiān)測(cè)，以及霉酚酸酯的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞霉酚酸酯 霉酚酸 血藥濃度 高效液相色譜法 藥代動(dòng)力學(xué)

Simultaneous determination of the concentration of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in plasma by HPLC

ZHU Shunhai1*, XU Zhiliang1, ZHAO Mengyun2, CHEN Jia2**

(1.Basic Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Zhongke (Hangzhou) Life Sciences Co. Ltd., Hangzhou 310052, China)

ABSTRACTObjective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of the concentrations of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in human plasma. Methods: The plasma sample was analyzed by HPLC on a Zorbax SB-C18column (4.6 mm×250 mm，5 mm) with 0.3% aqueous triethylamine - acetonitrile (50:50) as a mobile phase at the detection wavelength of 215 nm, column temperature of 35 ℃ and flow velocity of 1.0 ml/min after the proteins were precipitated out by acetonitrile. Results: The standard curve was linear over the range of 0.25 ~10 mg/ml with r(MPA)=0.999 76, r(MMF)=0.999 99. The recoveries of MPA and MMF were （87.38±2.97）% and（99.71±1.18）% and the limit of detection for MPA and MMF were 0.035 mg/ml and 0.070 mg/ml（S/N=3）. Conclusion: This method is simple, sensitive, reproducible, and suitable for the monitoring of the concentrations of mycophenolic acid and mycophenolate mofetil in patients with organ transplantation and the pharmacokinetic study of mycophenolate mofetil.

KEY WORDSmycophenolate mofetil; mycophenolic acid; blood concentration; HPLC; pharmacokinetics

霉酚酸酯(又稱麥考酚酸酯，mycophenolate mofetil，MMF)，商品名為驍悉（Cellcept），是霉酚酸(Mycophenolic acid， MPA)的嗎啉代乙酯。1995年5月霉酚酸酯獲得美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)可，用于預(yù)防腎移植急性排斥反應(yīng)，并在以后的應(yīng)用中取得了較好效果。1998年10月該藥成為美國(guó)正式批準(zhǔn)上市的具有免疫抑制作用的藥物[1]。作為免疫抑制劑，霉酚酸酯已廣泛應(yīng)用于預(yù)防腎臟等實(shí)體器官移植的急性排斥反應(yīng)[2]。MMF在體內(nèi)代謝為活性代謝物MPA而發(fā)揮作用，MPA主要通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性、可逆性抑制嘌呤從頭合成途徑的限速酶次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶（IMPDH），強(qiáng)烈抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖而發(fā)揮免疫抑制作用[3-4]。國(guó)內(nèi)臨床上應(yīng)用常規(guī)劑量（1～2 g/d）獲得理想效果，但由于MMF的個(gè)體間差異普遍存在，所以常規(guī)劑量可能會(huì)帶來(lái)個(gè)體間療效差異和不良反應(yīng)的出現(xiàn)。可通過(guò)監(jiān)測(cè)MMF和MPA的血藥濃度，制定個(gè)體化給藥方案，達(dá)到最佳療效

及最低不良反應(yīng)。目前針對(duì)MPA的血藥濃度含量檢測(cè)也比較多見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的主要有高效液相色譜法（HPLC）和酶放大免疫分析技術(shù)（EMIT）兩種方法。EMIT特異性不如HPLC，因?yàn)槠咸烟擒账岽x產(chǎn)物AcMPAG與MPA有交叉反應(yīng)， 因此， EMIT法測(cè)出的MPA濃度偏高，而HPLC 可單獨(dú)測(cè)MPA 濃度，不受AcMPAG的影響[5]。所以目前用的最多的是HPLC法[6-9]，但是同時(shí)對(duì)MMF 和MPA進(jìn)行血藥濃度測(cè)定不多。本文旨在建立HPLC法同時(shí)測(cè)定血漿中霉酚酸酯和霉酚酸的血藥濃度，其操作簡(jiǎn)單，分析速度快，有望適于臨床上開展MMF和MPA的血藥濃度監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化給藥的目標(biāo)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），德國(guó)IKAVortex 3渦旋混合器（廣州意測(cè)儀器有限公司），貝克曼Allegra 64 R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）。

1.2 試劑

霉酚酸酯及霉酚酸對(duì)照品（Sigma，含量：≥98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；甲醇和乙腈均為色譜純（南京榮華科學(xué)器材有限公司）；三乙胺（杭州蕭山創(chuàng)益化工儀器有限公司）與磷酸（杭州永星五交化有限公司）均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），流動(dòng)相：0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.3）-乙腈（50∶50），流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，進(jìn)樣量10 ml。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別精密稱取霉酚酸及霉酚酸酯對(duì)照品10.0 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定量至刻度，使它們質(zhì)量濃度都為1.00 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別精確吸取200 ml的霉酚酸和霉酚酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使之濃度為20.00 mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。繼而用甲醇稀釋成濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00及20.00 mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別進(jìn)樣10 ml，并記錄色譜圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 線性范圍

在“2.1”色譜條件下，將“2.2.2”配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別從低濃度到高濃度進(jìn)樣，以所得峰面積對(duì)相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（mg/ml）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)測(cè)得霉酚酸和霉酚酸酯在0.25 ~20.00 mg/ml的濃度范圍內(nèi)，其線性回歸方程分別為C=88.102 36A-8.368 51 （r=0.999 76）；C=58.397 29A+5.319 83（r=0.999 99）。表明其線性均良好。

2.4 樣品處理

取200 ml血漿樣品于1.5 ml Eppendorf管中，加乙腈800 ml，渦旋振蕩2 min，15 000 r/ min離心10 min，取上清液10 ml進(jìn)樣分析。記錄色譜圖，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得霉酚酸及霉酚酸酯的濃度。

2.5 色譜圖

在2.1項(xiàng)色譜條件下，霉酚酸和霉酚酸酯分別在4.5 min和8.5 min左右出峰，血漿中其他雜質(zhì)基本在4 min內(nèi)洗脫下來(lái)。對(duì)照品、空白血漿樣品和加標(biāo)血漿樣品以及患者口服1.0 g驍悉膠囊0.5 h后的血漿樣品色譜峰見(jiàn)圖1。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的精密度，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用空白血漿稀釋配制成含MPA和MMF 0.25、10.00及20.00 mg/ml血漿溶液，按2.4項(xiàng)方法處理，在2.1項(xiàng)色譜條件下，獲得色譜圖，外標(biāo)法讀取MPA和MMF的濃度。在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)（n=5）分別考察方法的精密度和重復(fù)性。結(jié)果顯示均符合體內(nèi)血藥濃度分析要求（RSD%≤10%，表1）。

圖1 霉酚酸和霉酚酸酯的色譜圖

表1 MPA、MMF血藥濃度測(cè)定的精密度（n=5）

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

按2.6項(xiàng)同法操作，測(cè)定加標(biāo)回收率（每個(gè)濃度平行測(cè)得5次），以考察方法的準(zhǔn)確度。以測(cè)得的量與加入量之比作為回收率的值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 MPA、MMF血藥濃度測(cè)定的回收率（n=5）

2.8 方法檢出限

選取空白血清，添加MPA、MMF混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得添加濃度依次為0.025、0.035、0.050、0.070 和0.10 mg/ml，按2.6項(xiàng)同法操作，以考察方法檢出限。我們以S/N=3計(jì)，得到霉酚酸和霉酚酸酯在本方法中的檢出限分別為0.035 mg/ml和0.070 mg/ml。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用空白血漿稀釋成濃度為5.0 mg/ml的模擬血漿樣品4份，均在室溫保存，分別于0、2、24和48 h按2.4項(xiàng)下方法處理樣品，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的回收率（表3）。參照2010版藥典規(guī)定，如相對(duì)回收率在80%～120%范圍內(nèi)，即認(rèn)為樣品沒(méi)有明顯差異。結(jié)果顯示室溫對(duì)MPA及MMF血藥濃度沒(méi)有明顯影響，在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 血樣在室溫下放置不同時(shí)間對(duì)MPA、MMF的回收率影響

2.10 血樣數(shù)據(jù)

腎臟移植患者口服1.0 g驍悉膠囊后，分別于0、0.5、1、2和6 h采集血樣，分離出血漿，HPLC分析結(jié)果顯示他們血漿內(nèi)的MMF濃度均為0，可見(jiàn)MMF體內(nèi)吸收迅速（表4）。

表4 腎臟移植患者口服MMF后MPA的血藥濃度（mg/ml）監(jiān)測(cè)

3 討論

pH對(duì)MMF和MPA峰型影響很大，可能是由于酚

羥基及羧基與色譜柱的硅醇基結(jié)合較緊密，導(dǎo)致峰型不好和拖尾現(xiàn)象，因此合理的pH至關(guān)重要。我們經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)0.3%的三乙胺水溶液的pH用磷酸調(diào)到5.3左右時(shí)，峰型較對(duì)稱。乙腈-0.3%的三乙胺水溶液為50∶50時(shí)，MPA和MMF可以很好地分離，且不受內(nèi)源性藥物的影響。

本方法采用乙腈沉淀蛋白方法處理血漿樣品，快速、簡(jiǎn)單，MMF和MPA在10 min之前均能出峰且回收率和重現(xiàn)性好，非常適合臨床上患者服用MMF后的血藥濃度監(jiān)測(cè)及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

口服霉酚酸酯后，體內(nèi)迅速吸收，在血漿酯酶作用下變成具有生物活性的霉酚酸。本文研究表明腎臟移植患者口服霉酚酸酯膠囊（1.0 g）0.5 h后幾乎檢測(cè)不到MMF，但這并不意味著檢測(cè)MMF的血藥濃度毫無(wú)意義。因?yàn)?，一方面，檢不出MMF的含量就說(shuō)明了患者體內(nèi)有足夠或相當(dāng)量活性的血漿酯酶；另一方面，血漿酯酶存在個(gè)體差異，在血漿酯酶活性極低的患者，可能能夠檢出MMF[9]，對(duì)這類患者，同時(shí)檢測(cè)MMF和MPA的血藥濃度有重要的臨床意義。

有文獻(xiàn)研究報(bào)道，MMF 的個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異較大， 在器官移植兩周后，服用1 g劑量的霉酚酸酯膠囊，不同患者間Co最大可相差21.4倍（0.32～6.86 mg/L），AUC 0-12 h最大可相差9.3倍（10.60～98.73 mg/L）[10]，即使同一個(gè)患者，在移植后數(shù)周內(nèi)的MPAAUC可升高30%~50%[11]。主要是可能受到移植腎功能、并發(fā)癥和聯(lián)合用藥等眾多因素的影響，造成患者服用同樣劑量，但不良反應(yīng)卻有顯著差異。因此，監(jiān)測(cè)MMF 和MPA的血藥濃度，有助于了解個(gè)體MMF的藥代動(dòng)力學(xué)，有望實(shí)現(xiàn)個(gè)性化給藥。

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收稿日期：（2014-11-11）

通訊作者：**許志良（1966-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事系統(tǒng)生物學(xué)的現(xiàn)代化研究。E-mail: xzl8811@163.com

作者簡(jiǎn)介：*朱順海（1988-），男，碩士研究生。E-mail: zsh261908@126.com

文章編號(hào)：1006-1533(2015)07-0077-04

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：O657.72; R979.5