劉志會(huì)天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津　301800

HPLC法測(cè)定土霉素片中的土霉素含量

劉志會(huì)
天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津301800

【摘要】目的:建立高效液相法測(cè)定土霉素含量的方法.方法:采用Agilent－C18(4. 6mm×250mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相:醋酸銨溶液－乙腈(85∶15);檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm;流速: 1. 0ml/min;柱溫: 30℃.結(jié)果:土霉素在0. 12－9. 6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r = 0. 9999，平均回收率為99. 2%，RSD =0. 6%(n =6).結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用土霉素片的質(zhì)量控制.

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法;土霉素;含量測(cè)定

土霉素是多環(huán)并四苯酸基酰胺母核的衍生物，為一種廣譜抗菌素，臨床上主要用于革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌感染，以及立克次體病、衣原體病、支原體病、螺旋體病的治療.目前土霉素片的含量測(cè)定方法為中國(guó)藥典規(guī)定的抗生素微生物檢定法，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·抗生素分冊(cè)(第一冊(cè)).該方法檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、影響因素多、易造成誤差，且不能滿足批量生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要.筆者采用高效液相色譜法取代效價(jià)法測(cè)定土霉素片的含量，其檢驗(yàn)周期短、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，現(xiàn)報(bào)道如下.

1　儀器與試藥

1. 1儀器UV－2401PC紫外分光光度計(jì)(日本島津); LC－2010AHT高效液相色譜儀(日本島津);梅特勒AG－135型電子天平;梅特勒TOLEDO型酸度計(jì)(精度: 0. 01 pH單位); KQ－5200E型超聲波清洗器.

1. 2材料土霉素對(duì)照品(批號(hào): 130487－200302，含量: 88. 2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所);土霉素片(批號(hào): 140113、140118、140105，規(guī)格: 0. 25g);所用試劑均為分析純.

2　方法與結(jié)果

2. 1色譜條件色譜柱: AgilentTM－C18(4. 6mm× 250mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相:醋酸銨溶液[0. 25mol/L醋酸銨溶液－0. 05mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液－三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至7. 5]－乙腈(85∶15);流速: 1. 0ml/min;柱溫: 30℃;檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm;進(jìn)樣量: 10μl.理論塔板數(shù)按四環(huán)素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，四環(huán)素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合中國(guó)藥典2010年版二部附錄VD規(guī)定(不低于1. 5).

2. 2溶液的制備

2. 2. 1對(duì)照品溶液的制備精密稱定土霉素對(duì)照品30. 31mg，置于50ml容量瓶中，用0. 01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0. 01mol/L鹽酸溶液稀至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液.

2. 2. 2供試品溶液的制備取土霉素片10片，精密稱定，平均片重0. 3578g，研細(xì)，精密稱取0. 3647g(約相當(dāng)于土霉素0. 25g)，置于500ml容量瓶中，用0. 01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5ml，置于25ml容量瓶中，用0. 01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液.

2. 3色譜測(cè)定分別精密量取對(duì)照品溶液(約0. 1mg/ml)和供試品溶液(約0. 1mg/ml)各10μl，注入液相色譜儀測(cè)定，即得.見圖1、2.

圖1　土霉素對(duì)照品的HPLC圖譜

圖2　土霉素樣品的HPLC圖譜

2. 4方法學(xué)考察

2. 4. 1精密度試驗(yàn)精密量取土霉素對(duì)照品溶液(0. 1mg/ml)10μl，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為0. 1%，說(shuō)明精密度良好.

2. 4. 2線性關(guān)系考察取上述土霉素對(duì)照品溶液(0. 1 mg/ml)，分別精取1、3、5、10、20、40、60、80 μl，注入液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣)，記錄峰面積.以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，得回歸方程: Y = 213450X－89963，r =0. 9999.

2. 4. 3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品(批號(hào): 140118)，分別于0、3、5、7、10、12、15、20、24、30h測(cè)定，結(jié)果RSD為0. 3%，表明樣品在30h內(nèi)穩(wěn)定.

2. 4. 4重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品(批號(hào): 140118)，依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定峰面積，計(jì)算土霉素含量.結(jié)果測(cè)得平均含量為95. 7%，RSD為0. 12%(n =6)，表明該法重現(xiàn)性良好.

2. 4. 5加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量(670. 34mg/g)的樣品6份，配置成所需濃度，和標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0. 53447mg/ml)，各5ml，置于50ml量瓶中，加0. 01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率.平均回收率99. 2%，RSD =0. 6%.結(jié)果見表1.

表1　回收率測(cè)定結(jié)果

2. 4. 6樣品的含量測(cè)定取三批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果批號(hào)為140113、140118、140105的土霉素樣品結(jié)果為95. 6%、95. 9%、95. 5%.按微生物檢定法測(cè)定三批樣品結(jié)果為95. 1%、95. 2%、95. 0%.

3　討論

在實(shí)驗(yàn)中如果遇到土霉素主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離效果不能滿足實(shí)驗(yàn)要求，可以減少乙腈的比例，改變流動(dòng)相的極性，使土霉素主峰的保留時(shí)間延長(zhǎng)，達(dá)到其與雜質(zhì)峰分離的目的，具體改變多少，依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件反復(fù)摸索而定.

由試驗(yàn)結(jié)果可知，該方法簡(jiǎn)單、快捷、重現(xiàn)性好、靈敏度高，測(cè)定結(jié)果與微生物檢定法相吻合，并可批量檢測(cè)，可用于土霉素含量的質(zhì)量控制.

參考文獻(xiàn)

[1]WS1－C2－0007－89，四環(huán)素片[S]．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)．抗生素藥品(第一冊(cè))，1989．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M]．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010: 635－636．

收稿日期:( 2014. 12. 29)

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)06－0010－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R927．2