俞茜，劉雅麗，范勇

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程過(guò)程中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的差異表達(dá)研究

俞茜，劉雅麗，范勇△

摘要：目的探討人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程過(guò)程中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)改變及其作用。方法利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片檢測(cè)人體細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況。通過(guò)數(shù)據(jù)分析比較人體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞后lncRNA的差異表達(dá)，篩選出在重編程過(guò)程中可能發(fā)揮作用的lncRNA。結(jié)果人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜類似于胚胎干細(xì)胞而與體細(xì)胞不同。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與體細(xì)胞之間有3 156個(gè)差異表達(dá)lncRNA。通過(guò)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞重編程過(guò)程中有222個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。結(jié)論lncRNA在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)鍵詞：多能干細(xì)胞；核重編程；芯片分析技術(shù)；長(zhǎng)鏈非編碼RNA

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA［1］。起初該類RNA被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄垃圾或者是RNA聚合酶Ⅱ雜亂行為［2］。而近年來(lái)的研究表明，lncRNA在細(xì)胞生物、生理、病理過(guò)程中扮演著重要的角色，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝以及凋亡［3］。lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不一樣的關(guān)系，它們通過(guò)參與基因的表達(dá)調(diào)控或促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)展［4-5］。lncRNA在小鼠胚胎干細(xì)胞的分化過(guò)程中表現(xiàn)出表達(dá)差異性［6］，同時(shí)多種多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也對(duì)其進(jìn)行調(diào)控［7］。另一方面，lncRNA也參與調(diào)節(jié)多種成體干細(xì)胞的自我更新以及分化能力［8］，lncRNAs Xist就在造血干細(xì)胞長(zhǎng)期生存中發(fā)揮著不可替代的作用［9］。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是將轉(zhuǎn)錄因子體外轉(zhuǎn)入到分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種多能性細(xì)胞狀態(tài)［10］。分子表觀遺傳修飾分析表明，在細(xì)胞重組期間，幾乎重構(gòu)了整個(gè)表觀基因組，最終獲得與胚胎干細(xì)胞非常類似的蛋白表達(dá)以及miRNA基因表達(dá)譜的多能干細(xì)胞［11-12］。目前對(duì)細(xì)胞重編程過(guò)程尤其是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞過(guò)程中l(wèi)ncRNA的研究還非常有限。有研究發(fā)現(xiàn)，在重編程過(guò)程以及小鼠和人類的胚胎干細(xì)胞中存在特異性的 lncRNA，這些lncRNAs與重編程重要因子OCT4、NANOG以及SOX2表達(dá)有很大相關(guān)性［6］。lncRNA會(huì)影響細(xì)胞的重編程過(guò)程，重編程調(diào)節(jié)lncRNA（lncRNA-ROR）是一種發(fā)揮了重要調(diào)控作用的重編程編碼調(diào)控器，抑制他們的表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞的重編程效率［13-14］。但是lncRNA在這期間的變化還不是很明確。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81370766）

作者單位：廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編510150）

作者簡(jiǎn)介：俞茜（1990），女，碩士在讀，主要從事干細(xì)胞與生殖方面的研究

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通訊作者E-mail：yongfan011@gzhmu.edu.cn

本研究利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片，比較重編程前后人體細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之間lncRNA的表達(dá)差異，獲得在重編程過(guò)程中差異表達(dá)lncRNA，通過(guò)生物信息學(xué)分析找出可能在重編程過(guò)程中發(fā)揮重要作用的lncRNA。

1　材料與方法

1.1材料本研究使用的A966、17-17、ips-G、ips-A966-9、ips-A966-11、hES10細(xì)胞系均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室前期自主建系，建系方法詳見(jiàn)之前的實(shí)驗(yàn)工作［15］。其中A966為羊水細(xì)胞，ips-A966-9、ips-A966-11為由A966誘導(dǎo)而來(lái)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。17-17為皮膚成纖維細(xì)胞，ips-G為由17-17誘導(dǎo)而來(lái)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。hES10為胚胎干細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法羊水細(xì)胞的培養(yǎng)液為商品化的AmnioMAX-TM-II（GIBCO）培養(yǎng)基。皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基為含高糖的 DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Invitrogen），添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%雙抗（青霉素/鏈霉素，Pen/Strep）。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有matrigel的培養(yǎng)皿上，用mTeSR1培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液至可細(xì)胞傳代或可收集。細(xì)胞每4～5 d用EDTA消化傳代。所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2總RNA提取當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%的密度時(shí)，收集細(xì)胞使用 mirVanaTM RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556）提取Total RNA，詳細(xì)步驟參見(jiàn)使用說(shuō)明書。

1.2.3獲取cRNA用于芯片分析按照步驟進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，提取的總RNA的純化（QIAGEN RNeasy?Mini Kit），cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成，熒光標(biāo)記cRNA合成，cRNA純化（QIAGEN RNeasy?Mini Kit），cRNA濃度測(cè)定，cRNA樣品片段化和芯片雜交（4×180K microarrays），芯片洗滌，Agilent掃描儀中掃描。詳細(xì)步驟參照Agilent芯片分析方法要求。

1.2.4分析數(shù)據(jù)及作圖軟件利用Agilent Human lncRNA （4×180K）芯片對(duì)2株人體細(xì)胞系、3株人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系以及1株人胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)，以了解lncRNA在人體細(xì)胞重編程過(guò)程中的變化。對(duì)人體細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞之間表達(dá)差異的lncRNA進(jìn)行了進(jìn)一步整合分析。Feature Extraction軟件讀取數(shù)據(jù)Scan resolution 5 μm，PMT 100%，采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析。最后應(yīng)用GENESPRING12.0進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（Quantile normalization）。

2　結(jié)果

2.1各細(xì)胞系主成分分析（PCA）及基因表達(dá)譜聚類分析主成分分析結(jié)果顯示，體細(xì)胞羊水細(xì)胞A966與皮膚成纖維細(xì)胞17-17成分類似，而由其誘導(dǎo)而來(lái)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞ips-A966-9、ips-A966-11、ips-G則與胚胎干細(xì)胞hES10類似，見(jiàn)圖1A。通過(guò)Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片結(jié)果聚類分析發(fā)現(xiàn)人體細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之間存在4 031個(gè)基因的差異表達(dá)（表達(dá)差異大于2倍）?；虮磉_(dá)譜聚類分析顯示，3株人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系在基因表達(dá)方面更類似于胚胎干細(xì)胞而與其對(duì)應(yīng)的體細(xì)胞不同，見(jiàn)圖1B。

2.2人體細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之間lncRNA表達(dá)譜聚類分析表達(dá)譜聚類分析結(jié)果顯示，人體細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之間存在3 156個(gè)lncRNA的差異表達(dá)。3株人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在lncRNA表達(dá)譜方面類似于人胚胎干細(xì)胞而與人體細(xì)胞不同，見(jiàn)圖2。

2.3人體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞重編程過(guò)程中l(wèi)ncRNA表達(dá)差異分析整合分析結(jié)果顯示，ips-A966-9、ips-A966-11與A966有6 965個(gè)lncRNA差異表達(dá)，ips-G與17-17有7 929個(gè)lncRNA差異表達(dá)，ips-A966-9、ips-A966-11和ips-G與hES10共有1 038個(gè)lncRNA差異表達(dá)。為了進(jìn)一步篩選出可能與重編程有關(guān)的lncRNA，筆者分析得出ips 與hES10，ips-A966-9、ips-A966-11與A966，ips-G 與17-17之間的差異表達(dá)lncRNA，最后取三者共有的差異lncRNA并取交集，結(jié)果顯示3對(duì)共有222個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，見(jiàn)圖3。這些差異表達(dá)的lncRNA在維持干細(xì)胞多能性及誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

3　討論

哺乳動(dòng)物基因組編碼大量的lncRNA，但大部分lncRNA的功能目前為止還不是特別明確。已有研究表明，lncRNAs在維持胚胎干細(xì)胞的多能性方面發(fā)揮著重要作用，且它們通過(guò)與核蛋白相互作用來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能［13］。重編程是在體細(xì)胞里過(guò)表達(dá)相關(guān)多能性基因使其轉(zhuǎn)變成類似于胚胎干細(xì)胞的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，基因表達(dá)發(fā)生了很大的變化，與此同時(shí)，lncRNA是否會(huì)發(fā)生變化呢？筆者利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片比較人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞后lncRNA的表達(dá)譜變化。為了確定各樣本之間的聯(lián)系以及實(shí)驗(yàn)的合理性，筆者對(duì)在本研究用到的細(xì)胞系進(jìn)行主成分分析。發(fā)現(xiàn)人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞后，lncRNA的表達(dá)發(fā)生了巨大變化。基因表達(dá)譜結(jié)果證實(shí)本研究使用的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在基因表達(dá)方面表現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞相似的特性。lncRNA聚類分析顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與誘導(dǎo)前的體細(xì)胞間lncRNA是有表達(dá)差異的，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的lncRNA表達(dá)更類似于胚胎干細(xì)胞。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的差異比較中有222個(gè)lncRNA的共有差異表達(dá)，這從側(cè)面反映了lncRNA可能在重編程過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)芯片數(shù)據(jù)分析得出lncRNA在重編程過(guò)程中表達(dá)是有發(fā)生變化的，但其是通過(guò)什么來(lái)作用以及怎么發(fā)揮作用的還不明確。已有研究表明，在建立以及維持多能性方面，染色質(zhì)重塑復(fù)合物起著至關(guān)重要的作用，而大量的lncRNA能夠通過(guò)與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用來(lái)調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)［16-18］。本研究分析得出的人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞差異表達(dá)lncRNA為進(jìn)一步研究其在干細(xì)胞多能性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用提供了新的思路。

致謝：感謝上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司在芯片數(shù)據(jù)分析方面提供的幫助。

（圖1～3見(jiàn)插頁(yè)）

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（2016-03-09收稿2016-04-17修回）

（本文編輯魏杰）

中圖分類號(hào)：Q28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20160135

Studies on the long non-coding RNA during the reprogramming of human pluripotent stem cells

YU Qian,LIU Yali,FAN Yong△
Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China
△Corresponding AuthorE-mail:yongfan011@gzhmu.edu.cn

Abstract:ObjectiveTo investigate the changes and roles of the long non-coding RNA（IncRNA）during the reprogramming of human induced pluripotent stem cells.MethodsAgilent Human lncRNA(4×180K)chip was used to check the expression of lncRNA in somatic cells,induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.Compared with differentially expressed lncRNA in somatic cells and induced pluripotent stem cells,lncRNA was selected that may play an important role during the reprogramming of human pluripotent stem cells.ResultsThe lncRNA expression profiles in induced pluripotent stem cells were similar to embryonic stem cells,but were different from the somatic cells.A total of 3 156 differentially expressed lncRNAs were found between stem cells and somatic cells by cluster analysis,and 222 differentially expressed lncRNAs were found during the reprogramming process of human pluripotent stem cells by biological analysis.ConclusionlncRNA may play an important role in reprogramming process of human pluripotent stem.

Key words:multipotent stem cells;nuclear reprogramming;microchip analytical procedures;long non-coding RNA