崔大煒++++++姜峰++++++陳大欣

[摘要] 目的 探討lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)意義以及對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力能力的影響。 方法 收集2012年5月～2015年12月于遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院手術(shù)切除的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本以及對應(yīng)的癌旁組織，采用real-time PCR技術(shù)分別檢測68例甲狀腺乳頭癌組織中MEG3表達(dá)情況，并分析其表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建MEG3高表達(dá)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞系，利用CCK-8方法檢測MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖能力的影響；采用Transwell方法檢測MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞侵襲遷移與轉(zhuǎn)移能力的影響；利用Western blot方法檢測過表達(dá)MEG3基因后對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞Snail2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；MEG3在甲狀癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期有關(guān)（P < 0.05），與其他病理參數(shù)無關(guān)（P > 0.05）；TPC-1細(xì)胞系中過表達(dá)MEG3可使甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力降低，并且能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力（P < 0.05）。real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MEG3能夠顯著抑制Snail2基因與蛋白的表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)顯著降低且與甲狀腺的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。MEG3能夠顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力，且能夠通過抑制Snail2蛋白的表達(dá)抑制狀腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。

[關(guān)鍵詞] MEG3；甲狀腺乳頭狀癌；長鏈非編碼RNA

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（b）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of lncRNA MEG3 in papillary thyroid carcinoma and explore the effect of MEG3 on proliferation， migration and invasion in PTC-1 cells. Methods 68 cases of papillary thyroid carcinoma specimens and paired normal tissue were collected after surgery from May 2012 to December 2015 in the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College. The expression of MEG3 was analyzed by quantitative real-time PCR. The effect of MEG3 on proliferation in TPC-1 cells was detected by CCK-8 method. The effect of MEG3 on migration and invasion abilities of TPC-1 cells were analyzed by Transwell assays. The expression of Snail2 was detected by Western blot. Results The expression of MEG3 was lower in papillary thyroid carcinoma tissues than adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression of MEG3 was related with TNM stage and tumor size （P < 0.05）. Over expressed MEG3 significantly inhibited the proliferation of TPC-1 cells （P < 0.05）. And MEG3 could decrease the abilities of migration and invasion by down regulating the expression of Snail2 （P < 0.05）. Conclusion The expression of lncRNA MEG3 is lower in the papillary thyroid carcinoma and can inhibit the proliferation， migration and invasion of TPC-1 cells can be inhibited by the expression of Snail2.

[Key words] MEG3； Papillary thyroid carcinoma； lncRNA

甲狀腺癌（Thyroid cancer，TC）是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其中最常見的病理類型。其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢且在頭頸部腫瘤中占主要地位[1-2]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的調(diào)控作用[3]。越來越多的研究證實(shí)，許多l(xiāng)ncRNA在甲狀腺癌中具有差異性表達(dá)且能夠影響甲狀腺癌的惡性生物學(xué)行為[4-6]。其中，lncRNA母系印記基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）作為通過表觀遺傳學(xué)受到表達(dá)調(diào)控的抑癌基因[7]，引起了人們廣泛的關(guān)注與研究，而MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況和意義尚不十分清楚。本研究擬通過檢測MEG3在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)情況，探討MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

68例甲狀腺乳頭狀瘤標(biāo)本及相對應(yīng)的癌旁組織為2012年1月～2015年12月于遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院行手術(shù)切除。所有標(biāo)本手術(shù)切除后立即放置于液氮中并存儲于-80℃冰箱以備實(shí)驗(yàn)使用。病理診斷由術(shù)后病理切片檢測為標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行碘131等治療。其中男性29例，女39例；年齡36～69歲，平均（44.7±5.4）歲，其中<45歲38例，≥45歲30例；腫瘤直徑<2 cm者44例，≥2 cm者24例；腫瘤病灶單發(fā)38例，多發(fā)30例；低分化28例，中、高分化56例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查，所有標(biāo)本檢測均經(jīng)患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 real-time PCR

所有甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織剪碎后，用Trizol試劑（invitrogen，San Diego，USA）提取組織總RNA，根據(jù)試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)（real-time PCR）體系按照SYBR Green說明書配制。real-time PCR反應(yīng)條件：95℃持續(xù)3 min；95℃變性5 s，退火60℃ 30 s，共40個循環(huán)。以MEG3基因與內(nèi)參GADPH相對濃度的比值來表示MEG3基因的表達(dá)量，相對表達(dá)量計(jì)算方式采用2-△△Ct法。MEG3基因的上游引物序列：5′-GCCAAGCTTC？鄄TTGAAAGGCC-3′，下游引物序列：5′-TTCCACGGAG？鄄TAGAGCGAGTC-3′；Snail2上游引物序列：5′-GAGGCGGTGGCAGACTAG-3′，下游引物序列：5′-GACACATCGGTCAGACCAG-3′；GADPH的上游引物序列：5′-CATGGAATCCTGTGGCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGATCTTCATGGTGCTGGG？鄄A-3′。

1.3 Western blot檢測

將轉(zhuǎn)染MEG3質(zhì)粒48 h的TPC-1細(xì)胞，利用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，蛋白樣本利用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜并用封閉液封閉2 h或4℃封閉過夜；轉(zhuǎn)膜后孵育Snail 2（Abcam，USA）、β-actin抗體（Proteintech，USA）后4 ℃溫育過夜。用TBST洗3次，每次10 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Pierce，USA）A、B各1 mL，混勻，浸透PVDF膜；暗室中進(jìn)行顯影。定量方法可利用Image J進(jìn)行灰度值分析并與內(nèi)參β-actin進(jìn)行比值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞系購于中科院細(xì)胞庫，利用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。MEG3過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MEG3購于基凱基因公司（上海），空載質(zhì)粒pcDNA3.1-NC為陰性對照。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）根據(jù)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率利用qRT-PCR檢測。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖利用CCK-8方法進(jìn)行驗(yàn)證。在96孔板中加入轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MEG3的TPC-1細(xì)胞系，100 μL/每孔（約3×103細(xì)胞）。對照組加入轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Nc的TPC-1細(xì)胞。分別在0、24、48、72 h進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。每孔加入10 μL的CCK-8溶液在37℃培養(yǎng)3 h。在450 nm進(jìn)行吸光度檢測細(xì)胞數(shù)量。

1.6 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的TPC-1細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度于5×105個/mL細(xì)胞懸液，分別置于24孔、8 μL的Transwell小室上層，侵襲實(shí)驗(yàn)中在上層底部覆蓋Matrigel生物膠。并在上室中加入100 μL不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔。37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將小室取出，用無水酒精固定15 min，結(jié)晶紫固定20 min，將小室倒置于相差倒置顯微鏡下觀察穿過半透膜附著于小室下層的細(xì)胞，任意選取5個視野，計(jì)數(shù)每高倍視野平均細(xì)胞數(shù)并同時(shí)照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況

real-time PCR檢測結(jié)果顯示，MEG3在甲狀腺乳頭狀癌中的相對表達(dá)值為0.36±0.08，癌旁組織中的相對表達(dá)值為0.85±0.17，MEG3在癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌中MEG3的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

為了進(jìn)一步了解MEG3對于甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，本研究分析甲狀腺乳頭狀癌組織中MEG3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。以MEG3表達(dá)的中位值為臨界值，將68例甲狀腺癌病例分為MEG3高表達(dá)組（34例）和MEG3低表達(dá)組（34例）。結(jié)果提示：甲狀腺乳頭癌中MEG3表達(dá)與TNM分期和腫瘤大小顯著相關(guān)（P < 0.05），而與患者性別、年齡、病灶數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P > 0.05）。見表1。

2.3 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖能力的影響

為了探索MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究通過CCK-8方法檢測增殖曲線的變化。首先，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)MEG3的TPC-1細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)染后比空載對照組MEG3表達(dá)上升（P < 0.05）。然后，利用CCK-8方法分別在0、24、48、72 h檢測細(xì)胞含量，分析結(jié)果表明MEG3過表達(dá)后能夠顯著抑制TPC-1細(xì)胞的增殖能力（P < 0.05）。見圖2。endprint

2.4 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

為了探求MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)MEG3的TPC-1細(xì)胞系，以空載質(zhì)粒為對照組，利用Transwell小室培養(yǎng)48 h，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下放大200倍進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，MEG3能夠顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1侵襲與轉(zhuǎn)移能力（P < 0.05）。見圖3。

2.5 MEG3對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞Snail2表達(dá)的影響

諸多研究表明，Snail2在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力中起到了重要的作用。因此，本研究通過PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)探求MEG3基因?qū)τ诩谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞Snail2的表達(dá)是否起到了調(diào)控作用。如圖4所示，當(dāng)過表達(dá)MEG3基因后TPC-1細(xì)胞中Snail2蛋白與mRNA的表達(dá)顯著降低（P < 0.05）。

3 討論

哺乳動物基因組中超過90%的基因均無編碼功能，在過去人們一直認(rèn)為這些基因是無功能的。而隨著人類基因計(jì)劃的完成，一直認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪聲”的非編碼RNA被證實(shí)在細(xì)胞的生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[8]。其中根據(jù)長度分類，人們將長度大于200個堿基的非編碼RNA稱為lncRNA[9]。不斷有研究證實(shí)，許多l(xiāng)ncRNA在甲狀腺中存在差異性表達(dá)，并且能夠?qū)谞钕侔┑陌l(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[4，10-11]。Li等[12]發(fā)現(xiàn)lncRNA n340790在甲狀腺癌中差異性高表達(dá)，并且能夠通過海綿效應(yīng)直接吸附miR-1254從而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖。Luo等[13]通過對64例甲狀腺癌組織進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PANDAR呈高表達(dá)趨勢，并且通過細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA-PANDAR能夠促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，抑制細(xì)胞的凋亡。諸多研究均表明lncRNA在甲狀腺癌中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

lncRNA MEG3位于人類染色體14q32.2位置，在正常組織中具有一定表達(dá)水平[7]。而在許多腫瘤中，MEG3被發(fā)現(xiàn)在癌組織中表達(dá)下降[14-15]。并且通過進(jìn)一步研究證實(shí)，MEG3能夠通過表觀遺傳學(xué)在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)受到甲基化水平的調(diào)控作用，因而其基因表達(dá)受到抑制[16-17]。如在胃癌研究中，miR-148a能夠通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移蛋白酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）從而影響MEG3的表達(dá)[18]。而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)MEG3作為一個抑癌基因不僅能夠作為輔助診斷腫瘤發(fā)生的分子生物標(biāo)記物，而且能夠在多個層面影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。如：人們發(fā)現(xiàn)MEG3能夠抑制膀胱細(xì)胞增殖能力的同時(shí)，也能夠抑制其自噬的發(fā)生[19]。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，MEG3能夠通過發(fā)揮內(nèi)源性干擾RNA的功能吸附miR-21，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞上凋亡的發(fā)生。綜上所述，lncRNA MEG3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，而其對甲狀腺癌的影響尚處于探索階段。

本研究通過對68例甲狀腺乳頭狀癌臨床組織標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，MEG3在甲狀腺癌中呈相對低表達(dá)水平。結(jié)合臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MEG3的表達(dá)與TNM分期和腫瘤大小相關(guān)，與其他參數(shù)無關(guān)。再進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)MEG3能夠顯著促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌中TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在基因表達(dá)層面本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)MEG3能夠顯著抑制與腫瘤上皮間質(zhì)化相關(guān)的基因Snai2的表達(dá)。以上結(jié)果提示MEG3對于甲狀腺乳頭狀癌是具有抑癌作用的lncRNA，為甲狀腺癌新的治療靶點(diǎn)提供了有效的理論依據(jù)，但其具體的分子機(jī)制需要進(jìn)一步探索與證實(shí)。

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