張秀娟，楊 杰，孫永強，高鳳山

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連116622）

大約克豬SLA－1原核表達載體的構(gòu)建及表達

張秀娟，楊 杰，孫永強，高鳳山＊

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連116622）

摘 要：為構(gòu)建大約克豬SLA－1胞外區(qū)的原核表達載體及表達目的蛋白，試驗設(shè)計1對引物，經(jīng)PCR擴增獲得大約克豬SLA－1胞外區(qū)基因（命名為SLA－1－DYKe），將此片段克隆至pMD?19－T Simple Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切篩選陽性克隆菌并測序，將目的基因插入到原核表達載體pET－28a（＋）中，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）進行誘導(dǎo)表達，用SDS－PAGE檢測目的蛋白的表達情況，大量誘導(dǎo)提取包涵體并檢測。結(jié)果顯示，PCR成功擴增SLA－1－DYKe的胞外區(qū)，得到大小為837bp的目的基因，目的基因成功克隆至pMD?19－T Simple Vector，并獲得序列正確的重組質(zhì)粒。以得到的重組質(zhì)粒成功構(gòu)建了SLA－1－DYKe／pET－28a（＋）表達載體，目的蛋白大小約為34ku。本研究成功構(gòu)建了大約克豬SLA－1原核表達載體，獲得了表達蛋白，為今后研究大約克豬SLA－1的空間結(jié)構(gòu)和基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大約克豬；SLA－1基因；原核表達載體

大約克豬是中國引進的主要國外品系豬，其性能表現(xiàn)為增重快、飼料報酬高、瘦肉率高等，主要飼養(yǎng)在中國北方地區(qū)［1］。目前，國內(nèi)已經(jīng)對該品系豬進行了雜交等生產(chǎn)性能的研究［2－3］，然而，對于該品系豬基因資源方面的研究缺乏，尤其是涉及到與遺傳相關(guān)的免疫應(yīng)答基因。

主要組織相容復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是脊椎動物體內(nèi)重要的免疫應(yīng)答基因。按照功能和結(jié)構(gòu)的不同分為3類，分別為：MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ、MHC－Ⅲ。其中，MHC－Ⅰ類分子是由重鏈（MHC－Ⅰ）和輕鏈（β2m）以非共價鍵結(jié)合的二聚糖蛋白。重鏈由一系列相互連鎖的基因編碼，具有高度的多態(tài)性。MHC－Ⅰ類分子分為3個區(qū)，包括細(xì)胞質(zhì)區(qū)、穿膜區(qū)和胞外區(qū)。其中，胞外區(qū)包括α1、α2和α3亞區(qū)，每個亞區(qū)約含有90個氨基酸。α1和α2構(gòu)成抗原多肽結(jié)合槽，結(jié)合8～10個氨基酸的多肽［4－7］。

豬MHC又稱豬白細(xì)胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），是一種膜外表達蛋白［8］，由Vaiman等［9］于1970年發(fā)現(xiàn)。SLA－Ⅰ類分子重鏈含有3個功能性基因，分別為：SLA－1、SLA－2和SLA－3。其中，SLA－2在信號肽的起始部位比SLA－1和SLA－3多3個氨基酸殘基［10］。SLA－Ⅰ輕鏈分子只有一個等位基因β2m，二者非共價結(jié)合構(gòu)成SLA－Ⅰ分子，在體內(nèi)結(jié)合和遞呈抗原表位［11－13］。在3個SLA－Ⅰ類分子功能基因中，SLA－1基因多態(tài)性最強。SLA－1基因在體外能夠遞呈抗原多肽，并引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)和功能研究正在展開。2012年，Ye等［14］報道了斷奶后仔豬SLA－1及SLA－3在組織中的表達與大腸桿菌毒素基因F18的關(guān)系。Pedersen等［15］通過NetMHCpan軟件預(yù)測口蹄疫病毒多肽，預(yù)測的多肽部分能夠在體外與SLA－1＊0401結(jié)合，從而開始了SLA－1＊0401功能的研究。Cho等［16］建立了韓國本土豬SLA基因資源庫，其中含有多個SLA－1等位基因；同時，還報道了國外引進托佩克豬SLA－1胞外區(qū)基因的克隆，以及國內(nèi)部分地方飼養(yǎng)品系豬SLA－1基因的表達，但表達效果并不理想［17］。為進一步豐富豬SLA－1基因的結(jié)構(gòu)和功能研究，本試驗擬在前期研究的基礎(chǔ)上，選取大約克豬SLA－1等位基因，構(gòu)建其pET系列的原核表達載體，并獲得高表達蛋白，為今后研究大約克豬SLA－1的空間結(jié)構(gòu)及基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及質(zhì)粒 育肥期大約克豬SLA－1／pMD18－T質(zhì)粒、表達載體pET－28a（＋）和大腸桿菌TOP10、大腸桿菌BL21（DE3）菌株均由大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院基因和蛋白質(zhì)工程實驗室保存；pMD?19－T Simple Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2主要試劑NdeⅠ、XhoⅠ、IPTG、DL2000DNA Marker、DNA Ligase、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、氯化鈉、TEMED、三羥甲基甲烷、過硫酸銨、丙烯酰胺、N’N’－二甲基甲叉雙丙烯酰胺均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成 以大約克豬SLA－1為模板，設(shè)計擴增其胞外區(qū)的引物：pHBSLA－1－21FY（上游引物）：5′－GGGAATTCCATATGGGCCCGCATTCTCTGAGCTATTTC－3′；pHB21R－SLA－1－276（下游引物）：5′－AGTCTCGAGTTAAGGGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTCC－3′。

1.2.2亞克隆SLA－1的胞外區(qū) 以SLA－1－DYK／pMD18－T為模板，以pHBSLA－1－21FY／pHB21R－SLA－1－276引物對擴增SLA－1胞外區(qū)（命名為SLA－1－DYKe）。PCR擴增體系50μL：質(zhì)粒1μL，上、下游引物各1μL，10×ExTaqBuffer 5μL，dNTP（10mmo／L）1μL，ExTaq酶0.5μL，ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，66℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收目的基因，將目的基因與克隆載體pMD?19－T Simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌進行雙酶切鑒定，鑒定正確后送生物公司測序。

1.2.3目的基因與表達載體pET－28a（＋）的連接與鑒定 從培養(yǎng)的TOP10菌液中提取質(zhì)粒，進行雙酶切，然后回收，得到SLA－1胞外區(qū)基因SLA－1－DYKe，同樣將表達載體進行雙酶切，回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Amp的培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。然后挑取單菌落在含Amp的液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒（質(zhì)粒命名為pET－28a（＋）／SLA－1DYKe）。重組表達載體的構(gòu)建見圖1，NdeⅠ和XhoⅠ為限制性酶切位點；插入片段為SLA－1－DYKe，自帶終止密碼子TAA，插入片段長度為837bp，載體大小為5 369bp。

圖1　大約克豬SLA－1原核表達載體構(gòu)建Fig.1 Construction of SLA－1prokaryotic expressing vector in Yorkshire pig

1.2.4目的基因的誘導(dǎo)表達 取酶切鑒定連接成功的菌液100μL接種到5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)使D600nm達到0.4～0.6。然后向培養(yǎng)液中加入5μL誘劑IPTG（1mol／L），培養(yǎng)5h后，取1mL培養(yǎng)液離心，收集菌體，菌體經(jīng)2×SDS上樣Buffer變性后，SDSPAGE檢測目的蛋白是否表達。

1.2.5提取包涵體 取測序正確的菌液1mL接種到100mL含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使D600nm達到0.4～0.6，向培養(yǎng)液中加入100μL誘導(dǎo)劑IPTG（1mol／L），培養(yǎng)5h后，于4℃、4 000r／min離心10min，加入適量PBS，冰浴條件下超聲波破碎菌體，離心后用Washing Buffer反復(fù)洗3次，包涵體用重懸Buffer懸起，6 000r／min離心15min，除細(xì)胞碎片、棄上清，稱重。加入8mol／L尿素溶解包涵體，4℃過夜，SDS－PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1SLA－1胞外區(qū)基因的擴增

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約837bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

圖2　SLA－1胞外區(qū)基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification ofSLA－1gene

2.2亞克隆酶切鑒定

用回收試劑盒將目的基因回收，然后與pMD?19－T Simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在837bp處可見目的條帶，與該片段理論值相符（圖3）。

圖3　重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant vector cleaved usingNdeⅠandXhoⅠ

2.3構(gòu)建及鑒定重組表達載體

將重組質(zhì)粒SLA－1－DYKe／pMD19－T與pET－28a（＋）載體用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切檢測結(jié)果顯示，插入片段約837bp，與理論值大小一致（圖4）。

圖4　重組表達質(zhì)粒pET－28a／SLA－1－DYKe雙酶切鑒定Fig.4 Identification of the recombinant plasmids pET－28a／SLA－1－DYKe cleaved usingNdeⅠandXhoⅠ

2.4重組基因的誘導(dǎo)表達

將篩選到的陽性重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)有表達條帶，大小約為34ku，與理論值相符（圖5）。

2.5包涵體的提取

將鑒定為正確表達的重組菌大量誘導(dǎo)，提取包涵體，SDS－PAGE檢測結(jié)果得到的SLA－1－DYKe包涵體蛋白條帶大小約為34ku，與理論值相符（圖6）。

圖5　SDS－PAGE檢測SLA－3－DYKe的表達Fig.5 The detection of expression of SLA－1－DYKe proteins by SDS－PAGE

圖6　SDS－PAGE檢測SLA－1－DYKe包涵體Fig.6 The detection of inclusion body of SLA－1－DYKe by SDS－PAGE

3 討 論

大約克豬又稱為大白豬、大約克夏豬，原產(chǎn)于英國。由于大白豬體型大，繁殖能力強，飼料轉(zhuǎn)化率和屠宰率高及適應(yīng)性強，養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家均有飼養(yǎng)，是世界上最著名、分布最廣的主導(dǎo)瘦肉型豬種。

由于SLA在免疫調(diào)節(jié)及抗原遞呈等方面起著重要的作用，近年來人們對于SLA的研究越來越多，陳茜茜等［18］構(gòu)建了荷包豬SLA－2原核表達系并獲得了SLA－2的目的蛋白；姜巍等［19］報道了煙臺黑豬SLA－2原核表達載體的構(gòu)建并獲得表達蛋白；茍東洲等［20］構(gòu)建中國地方品系荷包豬及萊蕪黑豬SLA－3原核表達載體并獲得了目的蛋白。

SLA－1和SLA－2、SLA－3基因作為SLA－Ⅰ類分子的功能基因座，在體外能夠遞呈抗原多肽，并引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，對于系統(tǒng)地研究SLA具有重要的作用。目前，國內(nèi)外對豬SLA－1的表達研究報道不多，對其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)和功能研究未系統(tǒng)地展開。課題組曾經(jīng)報道了國外引進托佩克豬及國內(nèi)部分地方品系豬SLA－1基因在pET－21a（＋）載體中的表達［16－17］，但到目前為止，大約克豬SLA－1基因的表達研究鮮有報道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用pET－28a（＋）載體成功表達了大約克豬SLA－1胞外區(qū)基因，且蛋白表達含量在整個菌體蛋白中呈優(yōu)勢表達，并獲得了其包涵體蛋白。相較于前人報道pET－21a（＋）載體所表達的蛋白，本研究利用pET－28a（＋）載體所表達的蛋白質(zhì)帶有His標(biāo)簽，便于今后進行蛋白質(zhì)的親和純化；然而不利之處為pET－28a（＋）表達蛋白所攜帶的His標(biāo)簽蛋白可能會對蛋白的折疊產(chǎn)生輕微的影響，如果做精細(xì)的結(jié)構(gòu)研究，需要將His標(biāo)簽通過蛋白酶酶切掉，這為后續(xù)試驗帶來了一些額外的工作量。

4 結(jié) 論

本試驗成功構(gòu)建了大約克豬SLA－1原核表達體系，成功表達了SLA－1基因，獲得了包涵體蛋白，為今后進一步研究大約克豬SLA－1的結(jié)構(gòu)及功能奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號：Q786

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3121－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.006

收稿日期：2016－06－16

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目：豬源病毒CTL多肽表位與SLA－Ⅰ結(jié)晶研究（31172304）；2015年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目：育－大約克豬SLA－1原核表達載體的構(gòu)建及表達研究（20150086）；2014年大連大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目重點項目：育－大約克豬SLA－1原核表達載體的構(gòu)建及表達研究（2014066）

作者簡介：張秀娟（1993－），女，甘肅平?jīng)鋈?，學(xué)士，研究方向：生物工程，E－mail：1270853789＠qq.com

通信作者：＊高鳳山（1971－），男，河北懷安人，博士，教授，研究方向：分子免疫學(xué)和分子生物學(xué)，E－mail：gfsh0626＠126.com

Construction and Expression of SLA－1Prokaryotic Expressing Vector in Yorkshire Pig

ZHANG Xiu－juan，YANG Jie，SUN Yong－qiang，GAO Feng－shan＊
（CollegeofLifeScienceandTechnology，DalianUniversity，Dalian116622，China）

Abstract：In order to construct the prokaryotic expressing vector of SLA－1derived form Yorkshire pig and express the interest of protein，apair of primers was designed to amplify the extracellular domain ofSLA－1gene from Yorkshire pig（named SLA－1－DYKe）by PCR.Then the PCR product was cloned into pMD?19－T Simple Vector and transformed intoEscherichiacoliTOP10.After cleaved byNdeⅠandXhoⅠ，the positive clones were selected to be sequenced.Analyzing by biological soft，the fragment from positive clone with correct sequence was inserted into pET－28a（＋）and transformed intoE.coliBL21（DE3）.After induction and expression，the interest of protein was detected by SDS－PAGE.The results showed that the extracellular domain of SLA－1－DYKe was successfully amplified with the fragment length of 837bp.The interest ofSLA－1gene was successfully cloned into pMD?19－T Simple Vector and the positive recombinant plasmids with correct sequences were obtained.The SLA－1－DYKe from positive recombinant plasmids was further inserted into pET－28a（＋）.After transformed intoE.coliBL21（DE3）and induction，the SLA－1－DYKe was successfully expressed.The molecular weight of the protein was about 34ku.It was concluded that the prokaryotic expressing vector of SLA－1was constructed successfully from Yorkshire pigs and then the expressed protein was obtained，which would lay a base for studying on the structure and function of SLA－1from Yorkshire pig in the future.

Key words：Yorkshire pig；SLA－1gene；prokaryotic expressing vector