胡仁統(tǒng) 王俊利 韋葉生 陸 潞 韋貴將 黃 可 廖品琥 唐毓金

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，百色市 533000，E-mail：hurentong@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

廣西壯族人群白細胞介素-27基因rs181206C/T位點多態(tài)性的分布特點▲

胡仁統(tǒng) 王俊利 韋葉生 陸 潞 韋貴將 黃 可 廖品琥 唐毓金

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，百色市 533000，E-mail：hurentong@163.com)

目的 探討廣西壯族人群白細胞介素-27(IL-27)基因rs181206C/T位點的分布特點及其與不同地區(qū)和種族人群的差異。方法 采用單堿基延伸的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測168例廣西壯族人IL-27 rs181206C/T多態(tài)性，并與國際人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位點的基因型和等位基因頻率比較。結(jié)果 168例廣西壯族人中，檢出rs181206C/T位點有3種基因型，分別為CC、CT和TT。IL-27基因rs181206C/T位點最常見的基因型是TT(75.1%)，最常見的等位基因型是T(85.7%)。男性及女性間IL-27基因rs181206多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；廣西壯族人IL-27 rs181206C/T基因型及等位基因頻率與北京人、日本人比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與意大利人、非洲人比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IL-27基因rs181206C/T位點基因型和等位基因頻率在廣西壯族人群中的分布與其他種族和地區(qū)人群相比有差異。

白細胞介素-27；基因多態(tài)性；廣西；壯族

白細胞介素(interleukin，IL)-27是由Pflanz等在2002年首先發(fā)現(xiàn)，它是一個由IL-27p28和EB病毒誘導(dǎo)基因3亞單位組成的異二聚體細胞因子[1]。IL-27屬于IL-12細胞因子家族，因此與家族其他成員(IL-12、IL-23、IL-35)一樣，具有很多共同的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，而其生物學(xué)功能主要是在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)及固有免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用[2-3]。研究顯示，IL-27基因存在多種功能性多態(tài)性位點，而且這些多態(tài)性位點的遺傳易感性對多種疾病的發(fā)生發(fā)展有影響，例如自身免疫性疾病[4]、惡性腫瘤[5]、結(jié)核病[6-7]等。因此，分析IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)以及不同人群中的分布特點，可為探討IL-27基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性提供更多實驗依據(jù)，同時能進一步揭示IL-27基因多態(tài)性生物學(xué)功能和遺傳特性。本文采用SNaPshot單核苷酸多態(tài)性(single nuaeotide polymorphism，SNP)分型技術(shù)檢測168例廣西壯族人群IL-27基因rs181206C/T位點的遺傳多態(tài)性分布特點，并與國際人類基因組計劃(HapMap)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的北京、日本、意大利和非洲等地人群相應(yīng)的位點進行比較分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 168份檢測樣本取自廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的健康人員，樣本收集時間為2012年10月至2013年10月。受試者各項臨床及實驗室檢查指標均正常，籍貫均為廣西，且長期在廣西居住，向上追溯3代均為壯族的個體，無可查親緣關(guān)系；男98例，女70例，年齡18～71(39.53±14.39)歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提?。撼槿】崭轨o脈血2 ml，置入含乙二胺四乙酸-K2抗凝劑的血常規(guī)管保存；采用改良碘化鈉法提取白細胞總DNA，DNA保存-80℃冰箱備用。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)找到IL-27基因DNA全序列，選擇包含rs181206C/T位點的片段，通過Primer 5引物設(shè)計軟件設(shè)計出特異性最好且包含rs181206C/T位點的PCR上、下游引物和延伸引物。其中，rs181206C/T位點的上游引物序列為：5′-CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG-3′，下游引物序列：5′-GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC-3′，延伸引物序列為：5′-TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC-3′。然后進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl：0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μl，上、下游引物各1.0 μl，DNA 1.0 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，總體積不足20 μl用滅菌雙蒸水補充。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 15 min；94℃×30 s，60℃×30 s，72℃×20 s，共設(shè)35個循環(huán)，然后72℃×10 min。最后PCR擴增產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SNaPshot SNP分型技術(shù)：PCR擴增產(chǎn)物首先用蝦堿酶和外切酶Ⅰ(北京盛科公司)處理純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit試劑(上?；鄯f生物科技有限公司)進行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物通過蝦堿酶再次純化，然后采用ABI 3130XL測序儀對純化產(chǎn)物進行測序，最后用Gene Mapper 4.0(ABI公司)軟件對rs181206C/T位點進行分型分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及來源：根據(jù)測序結(jié)果直接計算rs181206C/T位點基因型和等位基因頻率；登陸NCBI查找HapMap公布的北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位點的基因型和基因頻率結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-27 基因rs181206C/T位點SNP分型結(jié)果 PCR擴增IL-27基因rs181206C/T位點的產(chǎn)物片段長度為218 bp，通過ABI 3130XL的SNP分型，結(jié)果顯示rs181206C/T位點有3種基因型，分別為CC、CT和TT，見圖1。

圖1 IL-27基因rs181206C/T位點SNP分型結(jié)果

2.2 IL-27基因s181206C/T位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果 IL-27基因rs181206C/T位點基因型的實際頻數(shù)和理論頻數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.018，P=0.991)，提示所選廣西地區(qū)壯族人群人總體代表性較好，見表1。

表1 168名壯族IL-27 rs181206 C/T基因型實際頻數(shù)與理論頻數(shù)比較(例)

2.3 IL-12基因rs181206C/T位點在廣西壯族人群中的分布 168名壯族人中，IL-27基因 rs181206C/T位點最常見的基因型是TT，占75.1%；最常見的等位基因型是T，頻率為85.7%。該位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族男女組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(基因型：χ2=1.404，P=0.496；等位基因：χ2=0.400，P=0.527)，見表2。

表2 不同性別IL-27基因rs181206C/T位點基因型及等位基因頻率比較(n，%)

2.4 IL-27基因rs181206C/T位點與其他地區(qū)人群的比較 168名廣西壯族人IL-27基因 rs181206C/T位點基因型和等位基因頻率與北京人(χ2=0.320，P=0.852；χ2=0.355，P=0.551)、日本人(χ2=0.656，P=0.720；χ2=0.638，P=0.424)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與非洲人(χ2=23.056，P<0.001；χ2=23.095，P<0.001)、意大利人(χ2=9.689，P=0.008；χ2=11.284，P=0.001)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 不同種族人群IL-27基因rs181206C/T位點基因型及等位基因頻率比較(n，%)

3 討 論

IL-27被發(fā)現(xiàn)最早是因為它具有促炎和抗炎作用，主要體現(xiàn)在促進輔助性T細胞1(T helper cell，Th1)反應(yīng)，因此被稱為促炎細胞因子[1，8]。但是單獨的IL-27并沒有明顯的直接刺激性，它只有在與IL-12或IL-2結(jié)合的情況下才能誘導(dǎo)NK細胞、T細胞產(chǎn)生促炎物質(zhì)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，并通過IFN-γ發(fā)揮作用[1]。有研究顯示，IL-27在幼稚CD4+T細胞分化為Th1的過程中起到關(guān)鍵性作用，而WSX-1是IL-27的受體，其在Th1分化中的角色已得到證實。試驗研究結(jié)果顯示，WSX-1表達陰性的大鼠IFN-γ表達量比野生型大鼠少，并且其對于胞內(nèi)寄生病原體碩大利什曼原蟲(Leishmaniamajor，L.major)具有明顯的易感性，L.major清除依賴Th1介導(dǎo)的反應(yīng)[9-10]。然而對于WSX-1表達陰性的大鼠只有在L.major感染早期IFN-γ的表達量才減少，在L.major感染后期，WSX-1表達陰性大鼠IFN-γ的表達量與野生大鼠相當(dāng)，因此認為IL-27/WSX-1信號只是在CD4+T細胞分化為Th1的初始階段被需要[11]。IL-27不僅具有促炎及抗炎作用，在機體抗結(jié)核免疫過程中，IL-27還具有促進單核巨噬細胞分泌IFN-γ以及促進自然殺傷細胞和CD8+T細胞發(fā)揮細胞毒活性等作用，參與免疫應(yīng)答[12]。

蛋白屬于功能物質(zhì)，在體內(nèi)的變化可能影響到其發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，而基因則影響到蛋白的合成和分泌，特別是基因某些SNP位點的變化則會抑制或者促進相應(yīng)蛋白的合成。IL-27基因多態(tài)性與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性也得到很多研究者的證實。Zhang等[13]對229例卵巢上皮瘤患者和206例健康人的IL-27基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，病例組rs153109位點CC、CT和TT基因型頻率和rs17855750位點GG、GT和TT基因型頻率與健康人群組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且在病例組患者中IL-27 rs17855750位點基因型GG和GT頻率明顯高于對照組，提示IL-27基因多態(tài)性與上皮卵巢癌的易感性相關(guān)。Nematollahi等[14]研究發(fā)現(xiàn)IL-27基因rs964位點基因型AA、AG和GG頻率在反復(fù)流產(chǎn)組與正常對照組間有差異，提示IL-27基因rs964可能是婦女反復(fù)流產(chǎn)的一個危險因素。Zhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)IL-27基因rs153109位點和rs17855750位點可能是引起膀胱癌的一個易感因素，并且膀胱癌患者IL-27蛋白表達水平降低。

很多研究已經(jīng)表明IL-27基因多態(tài)性與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前有關(guān)IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)、不同人群中是否有差異的研究報告還比較少，為了探討不同地區(qū)、不同人群中IL-27基因多態(tài)性的分布情況，本課題組采用單堿基延伸的PCR技術(shù)檢測168例廣西壯族人IL-27 rs181206C/T多態(tài)性，并與國際人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人、日本人、非洲人和意大利人的rs181206C/T位點的基因型和等位基因頻率進行比較，結(jié)果顯示，168例廣西壯族人中，男性與女性的rs181206C/T位點基因型和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明該位點基因型分布可能與性別無關(guān)。而廣西壯族人的rs181206C/T位點基因型、等位基因頻率與親緣關(guān)系最近的北京人、日本人比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是與親緣關(guān)系較遠的非洲人、意大利人比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這表明此位點基因型分布可能與地域和種族存在一定的關(guān)聯(lián)性，也符合“親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，親緣關(guān)系越遠，差異越顯著”的遺傳學(xué)規(guī)律。同時也說明了在種族進化過程中存在地域和種族的異質(zhì)性，而這種遺傳異質(zhì)性很可能是導(dǎo)致某些地域和種族高發(fā)某種疾病及同種疾病臨床表現(xiàn)不同的誘導(dǎo)因素之一。這為后續(xù)探討rs181206C/T位點與廣西地區(qū)某些高發(fā)疾病的相關(guān)性研究提供參考。

總之，廣西壯族人IL-27基因rs181206C/T位點基因多態(tài)性分布與不同地區(qū)人群有一定差異，這為進一步研究與IL-27相關(guān)的疾病，尤其是研究廣西地區(qū)某些特異性高發(fā)疾病與IL-27基因多態(tài)性相關(guān)性提供重要參考依據(jù)。

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Distribution characteristics of polymorphism of interleukin-27 rs181206 C/T gene locus in Guangxi population with Zhuang nationality

HURen-tong,WANGJun-li,WEIYe-sheng,LULu,WEIGui-jiang,HUANGKe,LIAOPin-hu,TANGYu-jin

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective To explore the distribution characteristics of polymorphism of interleukin-27(IL-27) rs181206C/T gene locus in Guangxi population with Zhuang nationality,and the difference in polymorphism between this population and other population in different areas or with different races.Methods The polymorphism of IL-27 rs181206 gene locus was detected by single-base extension polymerase chain reaction technique in 168 individuals with Zhuang nationality from Guangxi.The genotype and allele frequencies of rs181206 gene locus were compared between the population with Zhuang nationality and population from China Beijing,Japan,Africa or Italy published by HapMap.Results In 168 individuals with Zhuang nationality from Guangxi,three genotypes of rs181206C/T gene locus were detected including CC,CT and TT.The most common genotype and allele of IL-27 rs181206C/T gene locus were TT(75.1%) and T(85.7%) respectively.There were no significant differences in the genotype and allele frequencies of IL-27 rs181206C/T gene locus between the male and the female(P>0.05).There were no significant difference in the genotype and allele frequencies of IL-27 rs181206C/T gene locus between Guangxi population with Zhuang nationality and the population from Beijing or Japan(P>0.05),but significant difference was found between Guangxi population with Zhuang nationality and the population from Italian or African(P<0.05).Conclusion There are significant differences in the frequencies of genotype and allele distribution of IL-27 rs181206C/T gene locus between Guangxi population with Zhuang nationality and the populations with other races or from other areas.

Interleukin-27,Gene polymorphism,Guangxi,Zhuang nationality

國家自然科學(xué)基金(81260315、81541136)；廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA053169)；廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2014520)；百色市科技攻關(guān)項目(20160610)

胡仁統(tǒng)(1988～)，男，碩士，檢驗技師，研究方向：惡性腫瘤的臨床分子診斷研究。

唐毓金(1966～)，男，博士，教授，研究方向：骨疾病相關(guān)機制研究，E-mail：tangyujin196709@163.com。

通信作者：廖品琥(1967～)，男，博士，教授，研究方向：惡性腫瘤的臨床分子診斷研究，E-mail：liaopinhu@163.com。

R 349.6

A

0253-4304(2016)07-0897-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.01

2016-02-21

2016-05-20)