王　浩，趙　青，陳妹紅(.河北省保定市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 07000；.河北省保定市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 07000；3.河北省保定市第一中心醫(yī)院功能科，河北 保定 07000)

?

·論著·

病醫(yī)院主管技師，從事臨床病原微生物診斷研究。

Sensititre?結(jié)核藥敏板檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏的方法學(xué)研究

王浩1，趙青2，陳妹紅3*(1.河北省保定市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000；2.河北省保定市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000；3.河北省保定市第一中心醫(yī)院功能科，河北 保定 071000)

[摘要]目的評價(jià)使用Sensititre?結(jié)核藥敏板進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的價(jià)值。方法分別使用Sensititre?結(jié)核藥敏板和L-J比例法對124株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、對氨基水楊酸、乙硫異煙肼、環(huán)絲氨酸、卡那霉素)，并將兩法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果使用Sensititre?結(jié)核藥敏板和L-J比例法對124株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的臨床分離株進(jìn)行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、對氨基水楊酸、乙硫異煙肼、環(huán)絲氨酸、卡那霉素等12種藥物的敏感性試驗(yàn)。其敏感度、特異度均較好。各藥的符合率都達(dá)到了90.0%以上。結(jié)論使用Sensititre?結(jié)核藥敏板所得的藥敏結(jié)果與傳統(tǒng)的L-J比例法有較高的一致性，且其檢測時(shí)間較短、操作更為簡單，同時(shí)還能獲得抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度值。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌；微生物敏感性試驗(yàn)；治療結(jié)果

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.016

近年來，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性問題正在形成并呈上升態(tài)勢，已嚴(yán)重影響人們的健康。世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年新發(fā)的耐多藥結(jié)核(multi drug resistant tuberculosis，MDR-TB)病例約500 000起，而其中耐藥結(jié)核發(fā)生率較高的國家里就有中國。在我國，各地結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室一般都是采用絕對濃度法或者L-J比例法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)，但世界衛(wèi)生組織一直在倡導(dǎo)使用液體培養(yǎng)基去做細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)[1]。在本研究中，我們使用了美國賽默飛世爾公司生產(chǎn)的Sensititre?結(jié)核藥敏板，這是一款專門用于測驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥物敏感性試驗(yàn)的藥敏板，采用的是微量肉湯稀釋法，通過一次檢測即可獲得12種一、二線抗結(jié)核藥物的藥敏結(jié)果，同時(shí)又可得到該細(xì)菌的最低抑菌濃度值(minimum inhibitory concentration，MIC)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源本研究所涉及的124株結(jié)核分枝桿菌系河北省保定市傳染病醫(yī)院結(jié)核科2013年8月—2014年4月期間住院患者的痰標(biāo)本培養(yǎng)物，經(jīng)菌種鑒定的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(本研究所有菌種均使用由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑鑒定為結(jié)核分枝桿菌)。參照菌株系用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294),購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1L-J比例法相關(guān)試劑鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、對氨基水楊酸、利福布汀、莫西沙星等含藥羅氏培養(yǎng)管以及對照用中性羅氏培養(yǎng)管均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。環(huán)絲氨酸、乙硫異煙肼的含藥羅氏培養(yǎng)管為本室自配，原料購自Sigma公司[2]。

1.2.2Sensititre?結(jié)核藥敏板相關(guān)試劑Sensititre?結(jié)核藥敏板、含玻璃珠的吐溫80鹽水磨菌管、含油酸、白蛋白、葡聚糖、觸媒(OADC)的7H9肉湯管[3]等均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。Sensititre?結(jié)核藥敏板的藥物排列和藥物濃度，見表1。

表1Sensititre?結(jié)核藥敏板的藥物排列和藥物濃度

Table 1　Drug arrangement and drug concentration of Sensititre Mtb plate(mg/L)

OFL：氧氟沙星；MXF：莫西沙星；RIF：利福平；AMI：阿米卡星；STR：鏈霉素；RFB：利福布??；PAS：對氨基水楊酸；ETH：乙硫異煙肼；CYC：環(huán)絲氨酸；INH：異煙肼；KAN：卡那霉素；EMB：乙胺丁醇；POS：陽性對照；CON：質(zhì)控

1.2.3相關(guān)儀器漩渦振蕩器：型號MX-F，購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；12道電子加樣槍、Sensititre?比濁儀以及Vizion藥敏判讀系統(tǒng)均購自美國賽默飛世爾科技有限公司

1.3藥敏試驗(yàn)24株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株分別用Sensititre?結(jié)核藥敏板和L-J比例法測試其藥物敏感性。將VERSATREK?自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀中報(bào)陽結(jié)核瓶取出，混勻后抽取瓶中全部菌液，經(jīng)3 000 g離心15 min，取其沉淀物放入含玻璃珠的吐溫鹽水磨菌管中，之后在漩渦振蕩器上混勻60 s充分研磨后，使用Sensititre?比濁儀調(diào)整磨菌管中菌液濃度至1麥?zhǔn)蠞岫取?/p>

1.3.1L-J比例法吸取1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?00 μL，并用生理鹽水稀釋至10-2g/L和10-4g/L的菌懸液，取稀釋好的菌懸液分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基。35 ℃培養(yǎng)4周左右，待菌落長好時(shí)觀察結(jié)果，并計(jì)算耐藥百分比，耐藥百分比>1%為耐藥(R)、≤1%為敏感(S)。

1.3.2Sensititre?結(jié)核藥敏板將剩余1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙河脽o菌生理鹽水調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫群?，吸?00 μL加到11.5 mL的含OADC的7H9肉湯管中，漩渦振蕩混勻30 s，使接種液最終濃度在5×104~5×105cfu/mL范圍內(nèi)。使用12道電子加樣槍接種菌液到藥敏板中，每孔100 μL，貼上封板膜后放入35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)藥敏板2個(gè)生長對照孔(11H孔和12H孔)的生長情況，在10~21 d內(nèi)使用Vizion藥敏判斷系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀。記錄生長明顯減少的最低抗生素濃度為MIC值，并依據(jù)各藥在瓊脂比例法中的關(guān)鍵濃度為其判定折點(diǎn)，如果MIC>關(guān)鍵濃度為耐藥(R)，如果MIC≤關(guān)鍵濃度為敏感(S)。

1.4質(zhì)量控制每周進(jìn)行質(zhì)控1次。質(zhì)控菌株為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)，該菌株對所有的抗結(jié)核藥均敏感。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析處理，Sensititre?結(jié)核藥敏板與L-J比例法藥敏試驗(yàn)測定時(shí)間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以L-J比例法檢測結(jié)果為判斷的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Sensititre?結(jié)核藥敏板的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度，2種方法檢測結(jié)果的一致性用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75(阿米卡星除外)，說明2種方法具有很好的一致性。阿米卡星的Kappa值略低的原因可能是在124個(gè)樣本中耐藥菌株的例數(shù)太少造成的。

2結(jié)果

2.1試驗(yàn)時(shí)間比較應(yīng)用Sensititre?結(jié)核藥敏板和L-J比例法對124株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群做藥敏試驗(yàn)后，Sensititre?結(jié)核藥敏板所需試驗(yàn)時(shí)間為10~18 d，平均(15.2±1.9) d，L-J比例法為20~31 d，平均(27.9±3.2) d，Sensititre?結(jié)核藥敏板比L-J比例法所需試驗(yàn)時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=38.001，P<0.01)。

2.2藥敏結(jié)果比較使用2種方法對臨床分離到的124株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、對氨基水楊酸、乙硫異煙肼、環(huán)絲氨酸、卡那霉素等藥物敏感性試驗(yàn)，其敏感度、特異度、準(zhǔn)確度均在90.0%以上，見表2。

表22種藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

Table 2The comparison of the results in two drug allergy testing experiments

藥物名稱 瓊脂比例法關(guān)鍵濃度(mg/L)Sensititre藥敏板結(jié)果L-J比例法結(jié)果(株數(shù))敏感耐藥敏感度特異度準(zhǔn)確度Kappa乙胺丁醇5 敏感耐藥113 101099.1%100.0%99.2%0.948異煙肼0.2敏感耐藥62 625491.2%96.4%93.5%0.871利福平1敏感耐藥90 213197.8%96.9%97.6%0.937阿米卡星5敏感耐藥120 11299.2%ND98.4%0.658環(huán)絲氨酸25敏感耐藥109 211298.2%92.3%97.6%0.875乙硫異煙肼5敏感耐藥109 0114100.0%93.3%99.2%0.961卡那霉素5敏感耐藥118 11499.2%ND98.4%0.792莫西沙星2敏感耐藥113 20998.3%100.0%98.4%0.891氧氟沙星2敏感耐藥99 312197.1%95.5%96.8%0.893對氨基水楊酸2敏感耐藥110 401096.5%100.0%96.8%0.816利福布汀0.5敏感耐藥91 132998.9%90.6%96.8%0.914鏈霉素2敏感耐藥73 434494.8%93.6%94.3%0.881

注：ND為not determined的縮寫，由于在124株樣本中耐藥菌株低于10個(gè)可能會(huì)造成特異度的不準(zhǔn)確性

3討論

目前我國結(jié)核病年發(fā)患者數(shù)約為130萬人，占全球發(fā)病的14.3%，居全球第2位，耐多藥結(jié)核病患者的估計(jì)人數(shù)居全球第1位。耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病的增長，給臨床治療帶來了極大的困難[4]。面對新的挑戰(zhàn)，需要用新的眼光或者說是新的技術(shù)來審視抗結(jié)核藥物的合理應(yīng)用，尤其是要重視初治以及非耐多藥結(jié)核患者的規(guī)范用藥，阻斷耐藥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，才能最終達(dá)到控制耐藥結(jié)核病的流行[5]。而采取一種快速、準(zhǔn)確、全面的結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)技術(shù)又是實(shí)現(xiàn)抗結(jié)核藥物合理使用的基石。

目前，多數(shù)醫(yī)院廣泛使用的仍然是L-J比例法，其局限性為試驗(yàn)比較繁瑣，結(jié)果受多種因素影響，重復(fù)性較差，在得到純培養(yǎng)物后仍需4周時(shí)間才可報(bào)告結(jié)果；同時(shí)L-J比例法由于無法測定細(xì)菌的MIC值，只能間接推斷該測試藥物的敏感或耐藥，其對結(jié)核菌耐藥程度的高低無法作出判定，所以不能運(yùn)用現(xiàn)在所提倡的藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)結(jié)合理論制定抗生素個(gè)體化給藥方案[6]。這種傳統(tǒng)藥敏方法的使用遠(yuǎn)滯后于臨床診治的需要[7]。本研究中所用美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)的Sensititre?結(jié)核藥敏板是一款使用微量肉湯稀釋法檢測MIC值的產(chǎn)品，該藥敏板對每種測試藥物由高到低做了8種或7種藥物濃度，能真實(shí)地檢測出MIC值[8]。在本研究中，Sensititre?結(jié)核藥敏板試驗(yàn)平均報(bào)告時(shí)間為(15.2±1.9) d，明顯短于L-J比例法的(27.9±3.2) d。目前，臨床常用一線抗結(jié)核藥異煙肼的耐藥率最高，利福平次之，乙胺丁醇最低。因此，應(yīng)格外關(guān)注復(fù)發(fā)以及經(jīng)3個(gè)月治療痰檢抗酸桿菌仍陽性的患者是否已耐異煙肼和利福平，及時(shí)調(diào)整用藥。在目前耐單藥及耐多藥的結(jié)核分枝桿菌日益增多的環(huán)境下，應(yīng)該使用肉湯稀釋法檢測MIC值并結(jié)合每個(gè)具體患者的血藥濃度監(jiān)測來確定臨床治療方案。但不可否認(rèn)的是，當(dāng)前世界各國多數(shù)都沒有使用肉湯稀釋法檢測結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性，所以也就還未建立其MIC值的藥物敏感性判定界值。在本研究中，依據(jù)廠家的推薦，參考瓊脂比例法的關(guān)鍵濃度，并將其作為判定藥物敏感性的界值，經(jīng)過與L-J比例法做對比，兩法具有很好的準(zhǔn)確性。國內(nèi)劉相等[9]也進(jìn)行了類似的研究，得出了試驗(yàn)組比傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)對照組藥敏試驗(yàn)時(shí)間更短、結(jié)果更準(zhǔn)確、更能及時(shí)服務(wù)于臨床的結(jié)論。

本研究中，我們也深刻體會(huì)到，采用Sensititre?結(jié)核藥敏板進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)時(shí)需要注意幾個(gè)關(guān)鍵因素。①最終加入藥敏板微孔中細(xì)菌懸液的濃度一定要控制好。如果懸液濃度太高則無法區(qū)分孔底沉淀是細(xì)菌生長所致還是接種導(dǎo)致，幾個(gè)會(huì)影響MIC值的判定；如果濃度過低，會(huì)導(dǎo)致檢測時(shí)間延長。Sensititre?結(jié)核藥敏板推薦的濃度5×104~5×105cfu/mL范圍內(nèi)。②因?yàn)橐?H9肉湯中培養(yǎng)較長時(shí)間，因此保持整個(gè)過程的無菌操作、防止環(huán)境菌的污染是非常重要的。如果環(huán)境菌污染了藥敏板則將無法正確判讀MIC值。③藥敏板需長時(shí)間在35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可能會(huì)造成微孔內(nèi)水分蒸發(fā)，因此除使用試劑盒中自帶的封板膜封板外，還應(yīng)將藥敏板放入透明塑料袋內(nèi)熱合機(jī)熱合后再放入培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)。④為了防止試驗(yàn)過程中氣溶膠外泄發(fā)生的生物危害以及無菌操作的需要，試驗(yàn)全程一定要在B2級的生物安全柜中完成[10]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]World Health Organization. Treatment of tuberculosis:guidelines for national programmes[S]. 4th ed.Geneva:World Health Organization,2009:420.

[2]王甦民，趙德福，王國治，等.結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社，2006:46-52.

[3]趙雁林，劉志敏，王海英，等.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:186-188.

[4]張賀秋，趙雁林，馮曉燕，等.現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:4-5.

[5]肖和平.抗結(jié)核藥物的合理使用是控制耐藥結(jié)核病流行的基石[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014,37(10)：723-724.

[6]熊旭東.PK/PD參數(shù)與抗菌藥物的優(yōu)化用藥[J].抗感染藥學(xué)，2012，9(1)：11-13.

[7]孫自鏞，程黎明，管青，等.實(shí)驗(yàn)診斷臨床指南[M].3版.北京：科學(xué)出版社,2013:413-414.

[8]Hall L，Jude Clark SL. Evaluation of the Sensititre MycoTB Plate for Susceptibility Testing of the Mycobacterium tuberculosis Complex against First-and Second-Line Agents[J]. J Clin Microbiol,2012,50(11):3732-3734.

[9]劉相，呂翠環(huán)，李玉靜，等.兩種不同結(jié)核菌藥物敏感試驗(yàn)方法比較[J].河北醫(yī)藥，2012,34(7)：1077-1078.

[10]王潔，陸俊梅，黃曉辰，等.微量MIC檢測判斷結(jié)核分枝桿菌藥敏的方法學(xué)研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010,33(4)：315-319.

(本文編輯：劉斯靜)

Methodological study of Sensititer tuberculosis drug sensitive plate in detecting mycobacterium tuberculosis

WANG Hao1，ZHAO Qing2，CHEN Mei-hong3*

(1.Depatment of Clinical Laboratory， Infectious Disease Hospital of Baoding City， Hebei Province,

Baoding 071000，China; 2.Depatment of Clinical Laboratory， Children's Hospital of Baoding

City, Hebei Province, Baoding 071000, China; 3.Depatment of Functional Section， the

First Central Hospital of Baoding City, Hebei Province, Baoding 071000, China)

[Abstract]ObjectiveThe present study is designed to evaluate Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat in testing antituberculotics sensitivety to mycobacterium tuberculosis.MethodsTo assess the effectiveness of Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat,the sensitivety of different antituberculotics(isoniazid, rifampicin, ethambutol, streptomycin, levofloxacin, moxifloxacin, Amikacin, rifabutin, para aminosalicylic acid, ethionamide, cycloserine, kanamycin) was tested on 124 strains of Mycobacterium tuberculosis complex from clinical isolates by Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat or L-J propotion method.ResultsThe sensitivity and specifity of Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat in testing the antituberculotics sensitivety were about 90.0% or more,which was compared with the L-J proportion method.ConclusionThe effectiveness of Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat was consistent with that from the L-J proportion method,but it shortened the test duration and was more convenient.In addition,Sensititre? tuberculosis drug sensitive plat can get minimum inhibitory concentrations of the different antituberculotics.

[Key words]mycobacterium tuberculosis；microbial sensitivity tests；treatment outcome

[中圖分類號]R378.911

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)02-0187-04

通訊作者*。E-mail：bd7577637@sina.com

[作者簡介]王浩 (1977-)，男，河北保定人，河北省保定市傳染

[收稿日期]2015-04-24；[修回日期]2015-06-25