熊玉龍，姚宏偉，許賢林

(常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 常州 213000)

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大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)模型的簡易改進

熊玉龍，姚宏偉，許賢林*

(常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 常州 213000)

摘要：目的 建立穩(wěn)定簡易的大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)模型。方法 用F344大鼠作為供腎鼠，Lewis大鼠作為受體鼠，采取腎動、靜脈端端吻合術(shù)，輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合術(shù)。術(shù)后皮下注射環(huán)孢素A 5mg/kg連續(xù)10天，10天后切除對側(cè)腎臟。結(jié)果 手術(shù)時間約100～120min，手術(shù)成功率92.1%，受體存活8周以上。結(jié)論 我們改進的大鼠慢性排斥反應(yīng)模型可以穩(wěn)定建立，手術(shù)成功率高，可用于腎移植慢性排斥相關(guān)研究。

關(guān)鍵詞：大鼠；腎移植；慢性排斥反應(yīng)；動物模型

大鼠腎移植模型是研究腎移植相關(guān)的移植物排斥、免疫抑制、移植腎功能等必要的研究工具。Fisher早在1965年創(chuàng)立了大鼠腎移植模型[1]，不久White等人使用F344大鼠與Lewis大鼠成功建立了大鼠CAN模型(chronic allograft nephropathy)[2]。國內(nèi)報道陳金芝于1981年也成功建立了大鼠腎移植模型[3]，近些年所研究的大鼠腎移植模型大多是急性排斥反應(yīng)模型，由于慢性排斥反應(yīng)一般需要大鼠存活4～12周，因此對手術(shù)中器官冷熱缺血時間，圍手術(shù)期處理要求更高。我們總結(jié)了國內(nèi)外大鼠慢性排斥反應(yīng)模型的手術(shù)經(jīng)驗，并結(jié)合自身經(jīng)驗改進了該模型。現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料選用200g左右F344和Lewis雄性大鼠作為供受體(購于蘇州大學(xué)實驗動物中心)[4]，溫暖通風(fēng)條件下飼養(yǎng)。雙人雙目顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)，顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械集團有限公司)，3-0、7-0、10-0無損傷縫線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)。10%水合氯醛，4°C肝素鈉等滲鹽水(25U/mL)，HC-A離體腎保存液。

1.2手術(shù)步驟

1.2.1術(shù)前準備術(shù)前禁食12h，自由飲水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg，麻醉生效后固定于大鼠固定板，取腹部正中切口。用自制簡易拉鉤拉開腹壁，將腸管用濕棉簽輕輕拉出，以溫生理鹽水紗布包裹。

1.2.2摘取供腎分離暴露并結(jié)扎左腎上腺動靜脈，游離左腎動靜脈。游離腹主動脈上下端，并于腹主動脈分出腎動脈、髂動脈前分別留線待結(jié)扎，游離輸尿管膀胱并剪取直徑3mm的膀胱瓣。腎靜脈近端結(jié)扎剪斷，結(jié)扎腹主動脈留線，使用自制的插管(1mL注射器針頭尖磨平)將4°C肝素鈉等滲鹽水吊高1.2m經(jīng)腹主動脈灌注腎臟(圖1)(封三)，可以觀察到腎臟變成黃褐色。灌注過程中可修剪供腎腎蒂，近端離斷腎動脈，隨后將供腎置于HC-A離體腎保液中4°C保存。

1.2.3受體移植取受體鼠麻醉、固定，過程同供體鼠。游離左腎動靜脈，分別用無創(chuàng)微血管夾夾閉近端，遠端剪斷。包膜下切除左腎，將冷藏的供腎用4°C生理鹽水浸泡過的小紗布包裹置于供體的左腎窩。調(diào)整好位置后4°C肝素鈉等滲鹽水沖洗血管腔而后用10-0無損傷縫線端端吻合左腎動靜脈。①動脈采用連續(xù)縫合間斷打結(jié)法，先于動脈斷端兩側(cè)各縫一針作為標志線。連續(xù)縫合一面不拉緊，之后分別剪斷縫線最后一起打結(jié)，牽拉標志線翻轉(zhuǎn)斷端同法縫合背側(cè)。每一面需要4～5針，針隙過大時適當補針。②靜脈采用連續(xù)縫合，先于靜脈斷端兩側(cè)各縫一針。連續(xù)縫合腹側(cè)面，最后打結(jié)時候需要牽拉兩端標志線使縫線均勻分布。翻轉(zhuǎn)斷端，同法縫合背側(cè)面。③松開無創(chuàng)微血管夾，數(shù)秒鐘之后可觀察到大鼠腎臟由土黃色變成粉紅色。④輸尿管膀胱瓣吻合，在供體鼠膀胱上剪開適當大小圓孔，7-0無損傷縫線兩定點法連續(xù)縫合膀胱瓣。腹腔內(nèi)加入2mL溫生理鹽水、20萬單位青霉素，3-0縫線分別縫合肌層、皮膚。術(shù)后復(fù)溫2h后放回籠中，當天晚上給予5%葡萄糖鹽水自由飲用。肌注青霉素20萬單位3d，皮下注射環(huán)孢素A 5mg/kg連續(xù)10d，10d后切除對側(cè)腎臟。分別于4周，8周，12周處死大鼠取移植腎做病理檢查。

2結(jié)果

經(jīng)過反復(fù)對手術(shù)方式的調(diào)整，模型的熱缺血時間<30s，冷缺血時間<20min。供體手術(shù)時間20～30min，動脈吻合時間<25min，靜脈吻合時間<20min，總時間100～120min。模型手術(shù)成功率達92.1%，移植腎標本8周質(zhì)地變硬，明顯變大。鏡下單核細胞增多，小動脈內(nèi)膜呈同心圓增生，腎小球、腎小管間質(zhì)纖維化改變明顯，符合Banff 97慢性排斥反應(yīng)表現(xiàn)(圖2)(封三)。

3討論

3.1血管吻合方法國內(nèi)外大鼠腎移植血管吻合的手術(shù)方法有很多種，主要分為端端吻合和端側(cè)吻合兩大類。端側(cè)吻合將腎動、靜脈與腹主、下腔靜脈端側(cè)吻合，此法影響了受體鼠的全身血液循環(huán)。我們認為端端吻合并沒有因為血管細小而使得縫合變難，相反，端端吻合受體鼠不需要去分離腹主動脈旁結(jié)構(gòu)，大大降低損傷到身體大血管的危險，也使得手術(shù)過程得以簡化。臧崇森等[5]認同動脈端端吻合，主張靜脈使用Cuff套管吻合。我們實際操作中發(fā)現(xiàn)Lewis大鼠靜脈十分粗大，Cuff套管因為血管管徑大小問題局限性很大[6]。劉皎林等[7]認為腎移植動靜脈端端吻合最符合生理特點，并發(fā)癥最少。我們動脈采用連續(xù)縫合間斷打結(jié)法，此法可以省略間斷縫合需要不停調(diào)針的麻煩，在助手幫助下可縮短動脈縫合時間5～10min。

3.2尿路重建方法Daniller[8]使用了輸尿管內(nèi)套管進行尿路重建，但此法會導(dǎo)致嚴重的輸尿管缺血壞死。輸尿管帶膀胱瓣與受體膀胱吻合的方法首次見于Silber[9]，并取得滿意的移植效果。此法需要注意輸尿管周圍脂肪清除太多會影響血供，熟練使用顯微剪可以迅速分離輸尿管膀胱。另一種常見的尿路重建術(shù)即輸尿管端端吻合術(shù)，輸尿管端端吻合術(shù)可以節(jié)約手術(shù)時間，避免輸尿管迂曲，但存在對術(shù)者手術(shù)技藝要求高，術(shù)中無法有效檢測吻合效果，以及術(shù)后會發(fā)生顯著的慢性輸尿管梗阻的缺點。我們綜合考慮還是采用了輸尿管膀胱瓣吻合術(shù)，術(shù)后4周，8周，12周病理均顯示膀胱瓣血供良好，輸尿管蠕動正常，沒有梗阻。

3.3細節(jié)的改進

3.3.1麻醉麻醉劑量過少，大鼠術(shù)中蘇醒會導(dǎo)致應(yīng)激性事件的發(fā)生，大大降低其生存率。麻醉劑量過多，則會造成器官低灌注，腎血栓形成，花斑腎。我們采用10%水合氯醛3ml/kg一次性注射，術(shù)中按需要于腹腔滴加少量水合氯醛維持麻醉。效果良好，大鼠蘇醒時間可控。

3.3.2灌注我們之前采用小兒7號靜脈留置針進行腹主動脈插管灌注，操作中發(fā)現(xiàn)由于管腔是軟質(zhì)塑料，在灌注過程中極易發(fā)生扭曲、彎折導(dǎo)致灌注不進。插管處反流常需要用鑷子夾緊，而軟質(zhì)管子更易被夾閉。我們使用自制的插管(1mL注射器針頭磨平)具有良好的灌注效果，且管腔不會彎折。

總之，我們采用自制插管腎原位肝素鈉生理鹽水灌注，大鼠動靜脈端端吻合術(shù)，連續(xù)縫合間斷打結(jié)法縫合動脈。輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合，術(shù)后10d切除對側(cè)腎的方法成功建立了大鼠腎移植模型。我們改進的該模型手術(shù)成功率92.1%，8周可見明顯慢性排斥反應(yīng)，且具有手術(shù)時間短，操作簡便，重復(fù)性好等特點，可用于腎移植慢性排斥相關(guān)研究。

參考文獻：

[1]Fisher B，Lee S.Microvascular surgical techniques in research with special reference to renal transplantation in rat[J].Surgery,1965,58(5):904

[2]White E,Hildemann WH,Mullen Y.Chronic kidney allograft reactions in rats[J].Transplantation,1969,8(5):602

[3]陳金芝,夏穗生.大白鼠異體腎移植術(shù)[J].中華器官移植雜志,1981,2(2):73

[4]Shrestha B,Haylor J.Experimental rat models of chronic allograft nephropathy：a review[J].Int Nephrol Renovosc Dis，2014,23(7):315

[5]臧崇森,李祎,傅耀文,等.大鼠原位腎移植模型的建立[J].中國實驗診斷學(xué),2009,13(1):40

[6]李建,許亞宏.大鼠腎移植模型四種腎靜脈重建術(shù)式的比較[J].中華移植雜志,2013,7(4):208

[7]劉皎林,周洪瀾,王醫(yī)術(shù),等.改良的血管端端吻合法建立大鼠原位腎移植模型[J].中國實驗診斷學(xué),2012,16(2):229

[8]Daniller A，Buchholz R，Chase RA.Renal transplantation in rats with the use of microsurgical techniques：A new method[J].Surgery，1968，63(6):956

[9]Silber SJ，Crudop J.Kidney transplantation in inbred rats[J].American Journal of Surgery,1973,125(5):551

*通訊作者，E-mail:xianlinxu@126.com

中圖分類號：R-332

文獻標識碼：B

文章編號：2095-4646(2016)03-0197-02

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0197

(收稿日期：2016-02-04)