袁慎俊，陳濤

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002)

RNA干擾在腫瘤治療中的靶點(diǎn)研究

袁慎俊，陳濤

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002)

RNA干擾是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。通過RNA干擾技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，進(jìn)而為惡性腫瘤的治療提供一種嶄新的手段。本文就RNA干擾的機(jī)制、作用靶標(biāo)及相關(guān)的臨床應(yīng)用做一綜述。

RNA干擾；基因沉默；微小RNAs；長(zhǎng)非編碼RNAs；腫瘤治療

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是生物進(jìn)化過程中遺留下來的一種在轉(zhuǎn)錄后通過小RNA分子調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象[1]。其靶點(diǎn)特異性比小分子藥物更高，且不需要特殊的結(jié)合蛋白，可以直接作用于單克隆抗體無法到達(dá)的靶點(diǎn)，直接阻止某些基因翻譯產(chǎn)生致病蛋白，在源頭阻斷疾病發(fā)生，從而避免了使用小分子藥物或其他生物制劑在分子級(jí)聯(lián)通路下游治療疾病。腫瘤的發(fā)生是多個(gè)基因相互調(diào)控作用“失靈”的結(jié)果，當(dāng)前對(duì)腫瘤的治療主要是通過物理和化學(xué)的方法抑制DAN復(fù)制及細(xì)胞增殖，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞，然而這些方法不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)。而RNA干擾可以利用同一基因家族中多個(gè)成員具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可以使多個(gè)基因同時(shí)沉默，從而促使癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

1 siRNA與RNA干擾

RNA干擾是一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制，它由雙鏈RNA(Doublestranded RNA，dsRNA)啟動(dòng)，在Dicer酶的參與下，把RNA分子切割為小分子干擾RNA(Small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA)，并特異性地與mRNA的同源序列結(jié)合，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)實(shí)質(zhì)是將siRNA通過不同方式導(dǎo)入到細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)，將相應(yīng)的目的基因沉默掉，進(jìn)而使相應(yīng)的功能表型缺失。在動(dòng)植物體中，轉(zhuǎn)錄后基因沉默是通過dsRNA介導(dǎo)的，dsRNA在序列上與靶基因具有同源性。RNA干擾能夠高效沉默具有調(diào)節(jié)特殊生理/病理通路功能的靶基因，并且能夠在轉(zhuǎn)錄水平上通過siRNA下調(diào)靶mRNA[2]。有研究表明，人類疾病相關(guān)基因的過度表達(dá)將成為基于RNA干擾治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[3]。由于RNA干擾的高度特異性和低毒性，該技術(shù)已經(jīng)成為基因功能和基因治療方面的有效工具，并且可以治療傳統(tǒng)藥物無法治愈的各種人類疾病，比如高膽固醇血癥[4]、病毒性肝炎[5]、亨廷頓氏舞蹈癥[6]。

在惡性腫瘤中，RNA干擾可以沉默由基因擴(kuò)增、突變或者過表達(dá)而引發(fā)的癌基因。研究顯示，在腫瘤治療中，RNA干擾在細(xì)胞凋亡、自噬、腫瘤代謝和細(xì)胞衰老等方面取得了巨大成功[7]。目前，應(yīng)用基于RNA干擾的基因沉默來治療腫瘤已經(jīng)有了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，并且正在進(jìn)行中的藥物臨床試驗(yàn)有望替代傳統(tǒng)的腫瘤化療。

2 miRNAs作為RNA干擾的靶標(biāo)

MicroRNA(miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，由21～25個(gè)核苷酸組成。這些小的miRNAs通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNAs，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。最近有研究表明，miRNAs與癌癥有確切聯(lián)系，它們?cè)谀[瘤發(fā)生中扮演著癌基因或者抑癌基因的角色。進(jìn)一步的證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤進(jìn)展方面也起著重要作用，包括腫瘤血管生成[8]、轉(zhuǎn)移[9-10]以及對(duì)干預(yù)治療的反應(yīng)性[11]。因此，鑒別具有致癌作用的miRNAs對(duì)腫瘤治療有著深遠(yuǎn)影響。有報(bào)道顯示抑制參與致癌作用的miRNAs可以阻斷許多癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，如miR-21。Tomimaru等[12]證明轉(zhuǎn)染了抗miR-21的肝癌細(xì)胞對(duì)IFN-α/5-Fu的化療更加敏感了，而且在臨床患者的肝癌標(biāo)本中，miR-21的表達(dá)高低與患者對(duì)IFN-α/ 5-Fu聯(lián)合治療的反應(yīng)性和生存率有關(guān)。又如，全身給予肝癌移植瘤小鼠具有抗miR-221同工修飾的膽固醇或者抗miR-221的寡核苷酸可以增加小鼠的生存周期和顯著減少腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目及大小[13-14]。在子宮內(nèi)膜癌中，miR-let-7是下調(diào)的，并且Let-7 miRNAs與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生高度相關(guān)。一項(xiàng)調(diào)查顯示Let-7a在提升癌細(xì)胞的增殖方面能對(duì)抗Aurora-B的功能，并且是通過下調(diào)Aurora-B蛋白水平介導(dǎo)的[15]。Zhang等[16]證明miR-125b能通過調(diào)節(jié)抑癌基因Bak1的表達(dá)來促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡。miR-155的過量表達(dá)能夠減少SMAD5的表達(dá)和誘導(dǎo)TGF-β對(duì)淋巴瘤的生長(zhǎng)抑制[17]。Zhang等[18]構(gòu)建質(zhì)粒pSUPER-c-FLIP-siRNA并將其轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)由于c-FLIP-siRNA的干擾細(xì)胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)的表達(dá)明顯受到抑制。

除了miRNAs的多靶點(diǎn)受到調(diào)節(jié)外，其本身也可以受到體內(nèi)其他因子的影響。例如轉(zhuǎn)錄因子E2F1可以通過激活miR-17-92的表達(dá)來促進(jìn)各種腫瘤進(jìn)展。反過來miR-17-92也可以通過調(diào)控E2F的平衡使促凋亡的E2F1表達(dá)和促增殖的E2F3表達(dá)[19]。Egger等[20]一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)表明，表觀遺傳變異比如DNA甲基化和組蛋白修飾，能夠影響miRNAs的表達(dá)。例如，在5-Aza-CdR(一種DNA甲基化抑制劑)和苯基丁酸(一種組蛋白去乙酰酶抑制劑)治療的腫瘤中，miR-127在腫瘤細(xì)胞中顯著上調(diào)。Scott等用組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)抑制劑LAQ824處理乳腺癌細(xì)胞SKBr3，其miRNAs的轉(zhuǎn)錄受到明顯抑制[21]。這些發(fā)現(xiàn)表明多種致癌性miRNAs和表觀遺傳學(xué)藥物可以作為RNA干擾腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

3 lncRNAs作為RNA干擾的靶標(biāo)

長(zhǎng)非編碼RNAs(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是一組內(nèi)源性、長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、特異完整的開放閱讀框和無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA[22]。參與了一些生物過程如表觀遺傳調(diào)控[23-24]、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控[25]、細(xì)胞發(fā)育和分化[26]、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[22]。研究表明，在人類癌癥中l(wèi)ncRNAs的失調(diào)是一個(gè)重要特征。最近，多種lncRNAs被認(rèn)為在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵作用[27-28]。因此，可以預(yù)見致癌性lncRNAs可用于癌癥的診斷和預(yù)后判斷，并且可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。目前，最常用的方法是利用RNA干擾來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的lncRNAs水平或功能。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(MALAT1)是一個(gè)長(zhǎng)度大約8 000個(gè)核苷酸和位于染色體11q13上的核lncRNA，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)[29-30]。MALAT1能誘發(fā)各種腫瘤細(xì)胞的惡性潛能，并且這種作用可以通過抑制MALAT1得以逆轉(zhuǎn)。在肺腺癌中，通過RNA干擾使MALAT1沉默來下調(diào)運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)從而破壞細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[31]。下調(diào)MALAT1也可以影響EMT相關(guān)基因的表達(dá)，從而減少ZEB1、ZEB2和Slug的水平，增加E鈣黏附素的水平[30，32]。此外，低表達(dá)MALAT1的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞接種裸鼠可以影響腫瘤的形成和生長(zhǎng)，并且高表達(dá)MALAT1的肺鱗癌預(yù)后不良[32]。

另一個(gè)屬于lncRNAs子類的是HOX基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)，它是第一個(gè)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNAs。有臨床研究顯示：HOTAIR表達(dá)水平與多種腫瘤(如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等)的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)HOTAIR能抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而下調(diào)HOTAIR表達(dá)則降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力[33-34]。這些預(yù)示HOTAIR在癌癥生物學(xué)中扮演著極其重要的角色和顯示出了重要的臨床意義。HOTAIR參與了多樣生物過程造成的惡性表型，并且這種改變可以通過抑制HOTAIR得以逆轉(zhuǎn)。乳腺癌中HOTAIR的高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖和侵襲[35]。在癌細(xì)胞中HOTAIR能夠通過抑制MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)來減少細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移[36]。HOTAIR低表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞在小鼠異種移植瘤模型中能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[33]?？傊?，大量的研究正在進(jìn)一步明確lncRNAs的分子功能，基于RNA干擾lncRNAs的腫瘤治療可能成為一種新的治療方法。

4 RNA干擾的臨床試驗(yàn)

基于RNA干擾的腫瘤治療已經(jīng)成為了一項(xiàng)新技術(shù)，正在以前所未有的速度應(yīng)用到臨床中。第一個(gè)基于RNA干擾的抗腫瘤藥物CALAA-01(CALAA-01為RONDELTM注射配方與瞄準(zhǔn)癌癥治療的siRNA序列)，它是一類由環(huán)糊精分子包裹而成的納米顆粒，可以在實(shí)體瘤中累積，阻止其靶點(diǎn)RRM2(RRM2是核糖核酸酶的M2亞基，在細(xì)胞分裂過程中起重要作用)的翻譯，從而抑制癌細(xì)胞分裂。靜脈給藥CALAA-01對(duì)肝癌、黑色素瘤和尤因肉瘤異種移植瘤小鼠有顯著抗腫瘤效果，并且在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中沒有觀察到肝毒性和免疫反應(yīng)[37]。

由美國(guó)奧尼蘭姆(Alnylam)生物技術(shù)公司開發(fā)的ALN-VSP02，借用脂質(zhì)納米顆粒包被兩種針對(duì)VEGF和紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白的siRNAs，通過沉默與腫瘤組織血管生成相關(guān)的生長(zhǎng)因子的蛋白合成，來抑制腫瘤區(qū)血管的生成，達(dá)到將癌細(xì)胞“餓死”的效果。人體試驗(yàn)表明全身性遞送siRNA能夠減少腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)肝癌化療的敏感性，并且采用兩周一次的靜脈給藥ALN-VSP是安全的和耐受性良好[38]。siRNA的脂質(zhì)體復(fù)合物Atu027能夠靶向蛋白激酶N3，全身給藥時(shí)，能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)及淋巴結(jié)或肺的轉(zhuǎn)移，并且沒有劑量依賴性毒性[39-40]。由穩(wěn)定核酸脂質(zhì)顆粒(SNALPs)制備的polo樣激酶I(PLK1)[41]或VEGF的siRNA已經(jīng)被開發(fā)用來評(píng)估基于RNA干擾治療原發(fā)性肝癌或肝轉(zhuǎn)移癌患者的安全性和有效性。這些臨床試驗(yàn)表明，RNA干擾的發(fā)現(xiàn)不僅為抗癌藥物的開發(fā)提供了快速和嶄新的方法，而且也有可能成為治療癌癥的下一個(gè)新手段。

5 展望

RNA干擾技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療。對(duì)于癌癥來說，RNA干擾或許可以成為一個(gè)強(qiáng)有力的武器，尤其是對(duì)于目前還沒有靶向藥物的致癌基因。以MYC為例，該基因同很多種癌癥發(fā)生有關(guān)，但是目前還沒有對(duì)抗這個(gè)基因的有效藥物，RNA干擾則給研究者提供了一個(gè)有力工具，它不像小分子藥物和生物制劑通過抑制突變蛋白來控制癌癥，而是直接阻斷蛋白產(chǎn)生過程。隨著RNA干擾技術(shù)的不斷研究深入及基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，相信在不久的將來，RNA干擾將成為腫瘤治療的又一新手段。

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Application of RNA interference in cancer therapy.

YUAN Shen-jun,CHEN Tao.Medical College of Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

RNA interference(RNAi)is a post-transcriptional gene silencing.With RNAi technique,we can specially reject or shut off the expression of certain genes and thereby provide a new therapy for maligant tumors.In this paper,the mechanism of RNAi,the target and related clinical applications are reviewed.

RNAi;Gene silencing;miRNAs;lncRNAs;Cancer therapy

R730.5

A

1003—6350（2016）01—0085—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.030

2015-05-07)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81173612)

陳濤。E-mail：chentao@ctgu.edu.cn