程 丹 湯紹遷

微小RNA在肝纖維化中作用的研究進(jìn)展

程 丹 湯紹遷

微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，是調(diào)控蛋白質(zhì)生物合成的一類重要的非編碼RNA。關(guān)于miRNA在肝纖維化中的作用一直是近年來的研究熱點。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中存在異常表達(dá)，并在調(diào)控肝纖維化相關(guān)的信號通路和肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖、分化和凋亡中起重要作用。此文就近年來有關(guān)miRNA在肝纖維化中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

肝纖維化；miRNA；肝星狀細(xì)胞

肝纖維化是由各種病因(肝炎病毒、乙醇、血吸蟲及藥物等)所致的慢性肝損傷的共同病理改變，是慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段。各種致病因素會引發(fā)肝細(xì)胞損傷、壞死及炎性反應(yīng)，激活肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞(如庫普弗細(xì)胞)，并分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-6等多種細(xì)胞因子，共同作用于肝星狀細(xì)胞(HSC)，促使HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腍SC，即肌成纖維細(xì)胞(MFB)，MFB加速了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白[包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)和肌間線蛋白]的合成與沉積，并最終導(dǎo)致肝纖維化[1]。隨著對肝纖維化病理的深入認(rèn)識，現(xiàn)認(rèn)為肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，甚至連肝硬化在某些情況下也是有可能逆轉(zhuǎn)的[2]，并且這種逆轉(zhuǎn)已經(jīng)在由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及其他原因所導(dǎo)致的肝硬化患者中觀察到[3-4]。 但是，由于肝纖維化的過程不易被察覺，以至于多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已進(jìn)展為肝硬化，加大了治療的難度。因此，如何在早期及時、有效地診斷肝纖維化，對于眾多肝病患者而言具有重大意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)可參與并調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)程，在HSC的激活及肝纖維化相關(guān)信號通路中發(fā)揮著重要作用。Zhang等[5]收集了慢性乙型肝炎和肝硬化患者的血漿，通過miRNA微陣列檢測不同分組的循環(huán)miRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)了12種在所有分組中均出現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA，包括10種上調(diào)的miRNA以及2種下調(diào)的miRNA。有關(guān)miRNA在肝纖維中的作用已成為近年來的研究熱點。

1 miRNA 的合成及其作用機(jī)制

真核生物細(xì)胞內(nèi)的miRNA主要有兩種來源：大部分的miRNA可通過特定的基因轉(zhuǎn)錄加工而產(chǎn)生；另一小部分miRNA可以從內(nèi)含子或長鏈非編碼RNA(lncRNA)中產(chǎn)生。許多miRNA都具有自身的獨立基因，通過RNA聚合酶Ⅱ(RNase Ⅱ)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這是miRNA產(chǎn)生的經(jīng)典途徑。在RNase Ⅱ的催化作用下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級前體miRNA(pri-miRNA)，然后經(jīng)過5′-端加帽，3′-端加poly A尾[6]。pri-miRNA 在RNase Ⅲ(Drosha)的催化下與雙鏈RNA結(jié)合蛋白DGCR8形成Drosha-DGCR8復(fù)合物，將pri-miRNA加工成一個約70 nt，含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體，稱為pre-miRNA[7]。pre-miRNA被隨機(jī)轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)中，在RNase Ⅲ(Dicer)催化下與雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP結(jié)合形成復(fù)合物，在TRBP協(xié)助下，Dicer將pre-miRNA進(jìn)一步裂解產(chǎn)生一個20 bp的miRNA/miRNA*雙鏈分子[8]。加工產(chǎn)生的短雙鏈RNA中的一條將與AG01/AG02結(jié)合并留在RISC中形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISC)，從而行使miRNA的功能，而另一條鏈則被釋放降解。

miRNA的主要功能是在翻譯水平調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，且以負(fù)調(diào)控作用為主。miRNA調(diào)控基因表達(dá)主要是通過miRNA以不完全互補(bǔ)的方式引導(dǎo)miRISC結(jié)合靶mRNA，與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合并阻止其翻譯；如果miRNA與mRNA的靶序列完全互補(bǔ)，則通過miRISC中的AG02發(fā)揮內(nèi)切核酸酶作用，促進(jìn)其降解[9-10]。

2 miRNA參與HSC的活化、增殖和凋亡

HSC的激活是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞[1,11]，近年來體外及體內(nèi)的研究表明，miRNA在HSC的激活中起著重要作用。

2.1 miRNA調(diào)節(jié)HSC活化

近期一項研究發(fā)現(xiàn)，在肝硬化患者和硫代乙酰胺(TAA)或 四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠纖維化模型的肝組織中，miR-21均呈高水平表達(dá)；下調(diào)miR-21和活化蛋白-1(AP-1)的表達(dá)后可觀察到HSC的活化顯著受到抑制，纖維化的程度則得以緩解；相反，用小干擾RNA抑制程序性細(xì)胞凋亡因子4(PDCD4)的表達(dá)后，則可以促進(jìn)HSC向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，加速肝纖維化的進(jìn)程，提示miR-21可通過miR-21/PDCD4/AP-1反饋回路維持其在肝纖維化過程中的高表達(dá)水平，并促進(jìn) HSC的活化[12]。Maubach等[13]通過體內(nèi)及體外的研究發(fā)現(xiàn)，與處于靜態(tài)的HSC相比較，激活后10 d的HSC中有16種miRNA表達(dá)上調(diào)及26種miRNA表達(dá)下調(diào)。Lakner等[14]通過miRNA微陣列分析對比處于活化和未活化狀態(tài)下HSC中miRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-34c、miR-184和miR-221的表達(dá)顯著上調(diào)，而另有8種miRNA(miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR-150和miR-194)的表達(dá)則顯著下調(diào)。Yan等[15]檢測了HSC處于絕對靜態(tài)的前3 d及激活后10 d的miR-34a和轉(zhuǎn)錄因子ACSL1的表達(dá)量，以及miR-34a沉默后HSC中ACSL1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-34a可能是通過直接靶向調(diào)節(jié)ACSL1的表達(dá)而參與肝纖維化進(jìn)程。

2.2 miRNA調(diào)節(jié)HSC的凋亡

Zheng等[16]通過基因微陣列發(fā)現(xiàn)miR-150在肝纖維化中的表達(dá)顯著降低，而在LX-2細(xì)胞株中高表達(dá)miR-150會抑制細(xì)胞的增殖，并減少ECM以及α-SMA的生成，提示miR-150在調(diào)節(jié)HSC的凋亡，抑制肝纖維化中起著重要作用。Dai等[17]的體外實驗研究顯示，在肝硬化患者的肝組織、血清以及活化的HSC中均發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)降低，而在高表達(dá)miR-155后發(fā)現(xiàn)HSC的凋亡顯著增加，并且抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1)信號通路的活性。在大鼠肝纖維化組織中，miR-150和miR-194同樣被發(fā)現(xiàn)在HSC中表達(dá)降低，而使其過表達(dá)后則會顯著抑制HSC的增殖，并減少α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的生成[18]。Wang等[19]通過體外實驗證實，miR-29在LX-2 HSC、LX-1以及HSC-T6細(xì)胞株中高表達(dá)后，會顯著抑制HSC的增殖并促進(jìn)其凋亡。

3 miRNA在肝纖維化相關(guān)信號通路中的作用

目前研究表明，肝纖維化是一個復(fù)雜的病理變化過程，受到多種信號通路及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，包括TGF-β/Smad、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-κB)以及Wnt/β-catenin等信號通路。

3.1 miRNA在TGF-β/Smad通路中的作用

TGF-β具有多種生物學(xué)作用，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、ECM沉積及ECM蛋白的合成和降解，是調(diào)控機(jī)體器官纖維化的核心通路[20]，其中TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)ECM基因表達(dá)以及促進(jìn)ECM生成的重要途徑[21-22]。Tu等[23]通過對大鼠肝纖維化模型的研究發(fā)現(xiàn)，miR-101可以抑制TGF-βⅠ型(TβRⅠ)在肝細(xì)胞和HSC中的表達(dá)，從而阻斷TGF-β信號通路在肝纖維化中的作用，進(jìn)而促進(jìn)活化的HSC逆轉(zhuǎn)為靜態(tài)的HSC；同時，在人肝細(xì)胞中，miR-101也可以通過阻止TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制肝纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的釋放。Lakner等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠活化的HSC中miR-19b的表達(dá)水平提高后，TGF-β通路中的組成成分TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)的表達(dá)量顯著降低，同時降低了Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)以及TGF-β介導(dǎo)的α1和α2型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，表明miR-19b可以抑制HSC中的TGF-β信號通路的活性。Roy等[24]在研究miR-30c和miR-193在肝纖維化中的作用時發(fā)現(xiàn)，TGF-β2和Snail1(調(diào)控ECM的關(guān)鍵因子)可能是miR-30c和miR-193的兩個作用靶點。

3.2 miRNA在PI3K/Akt通路中的作用

PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在肝纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)ECM的降解，可影響HSC的增殖和凋亡，參與肝纖維化的形成[25]。Wang等[19]將miR-29b轉(zhuǎn)導(dǎo)入CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中并使其高表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)miR-29b可調(diào)控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)并誘導(dǎo)HSC凋亡，且miR-29b可通過直接結(jié)合PIK3R1和Akt3的3′端UTR區(qū)域而抑制PI3K/Akt的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在敲除了PIK3R1或Akt3基因后會抑制α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)HSC的凋亡，表明miR-29b可以通過抑制PI3K/Akt信號通路，阻止HSC的激活并誘導(dǎo)其凋亡，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Xiao等[26]在研究miR-200b在人HSC系LX-2中的作用時發(fā)現(xiàn)，miR-200b可以提高Akt的磷酸化水平，用miR-200b模擬物(miR-200b mimic) 使其高表達(dá)后發(fā)現(xiàn)FOG2(miR-200b的靶蛋白，可以抑制PI3K/Akt通路的活化)的表達(dá)水平顯著降低，表明miR-200b可通過下調(diào)FOG2而激活PI3K/Akt通路，進(jìn)而刺激HSC的生長和遷徙。Wei等[27]在研究miR-21在人HSC系LX-2中的作用時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21的表達(dá)會刺激LX-2的增殖；相反，下調(diào)miR-21的表達(dá)則會抑制LX-2的增殖，同時發(fā)現(xiàn)miR-21的高表達(dá)會抑制LX-2細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)kt蛋白，而用miR-21的抑制劑LY294002抑制Akt信號通路后，可以阻止LX-2細(xì)胞的纖維化，表明miR-21可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而影響LX-2細(xì)胞的纖維化進(jìn)程。

3.3 miRNA在NF-κB通路中的作用

NF-κB能通過調(diào)控多種炎性因子以及抗炎因子的表達(dá)來影響肝臟炎性反應(yīng)的損傷修復(fù)，從而調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展；同時，NF-κB還能通過影響HSC的凋亡而參與肝纖維化的進(jìn)程[28-29]。Feng等[30]研究了miR-126在LX-2細(xì)胞系中的作用機(jī)制，利用miR-126類似物或抑制劑上調(diào)或下調(diào)miR-126表達(dá)后，觀察NF-κB蛋白、NF-κB抑制劑α(IκBα)的mRNA和蛋白的表達(dá)量以及NF-κB通路的下游信號分子TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)量，最終發(fā)現(xiàn)miR-126可以抑制IκBα的表達(dá)；相反，敲除miR-126基因則會上調(diào)IκBα的表達(dá)并抑制NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)程。Hyun等[31]在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型研究中發(fā)現(xiàn)，miR-378a-3p的表達(dá)明顯降低，將miR-378a-3p過表達(dá)后會顯著抑制HSC的活性；使用Smoothened激活NF-κB p65及其信號通路后，發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p的表達(dá)明顯降低，表明miR-378a-3p在NF-κB信號通路的調(diào)控下可以影響HSC的活化，進(jìn)而參與肝纖維化。

4 小結(jié)與展望

近年來隨著對肝纖維化研究的深入，miRNA在肝纖維化進(jìn)展、HSC活化和凋亡以及其相關(guān)信號通路中的作用越來越明確，這為肝纖維化患者的診斷及治療提供了新的靶點，具有十分重要的臨床意義。但目前仍有許多問題亟待解決，比如之前的研究大多局限于體外實驗，如何在早期有效診斷肝纖維化，miRNA能否作為一個早期診斷肝纖維化的生物學(xué)指標(biāo)，這些問題都需要進(jìn)一步的深入研究。相信隨著臨床試驗的進(jìn)展，終究會克服肝纖維化診斷及治療方面的難題。

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(本文編輯：周駿)

434020 湖北荊州，長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

湯紹遷，Email: jz-tsq@163.com

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