潘淑玲

【摘要】臨床檢測(cè)中，通常在診斷疾病時(shí)會(huì)結(jié)合腫瘤標(biāo)記物相關(guān)數(shù)據(jù)加以判斷，只是檢測(cè)單個(gè)腫瘤標(biāo)記物無(wú)法精確診斷該疾病。所以，同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)記物對(duì)精確診斷癌癥具有很大促進(jìn)作用。相比于以往分免疫分析，夾心免疫分析法具有較高樣品分析通量、較低樣品消耗以及較短分析時(shí)間。很多文獻(xiàn)都詳細(xì)綜述了夾心免疫分析本身的發(fā)展歷程。本研究主要基于夾心免疫分析法創(chuàng)建檢測(cè)癌胚抗原與甲胎蛋白的高靈敏肝微粒子酶促化學(xué)發(fā)光作一綜述。

【關(guān)鍵詞】夾心免疫分析法；甲胎蛋白；癌胚抗原；高靈敏度微粒子酶；化學(xué)發(fā)光

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2016）01-0023-02

1前言

癌胚抗原（CEA）與甲胎蛋白（AFP）是目前為止相對(duì)比較肯定的兩個(gè)腫瘤標(biāo)志物，現(xiàn)階段已經(jīng)在診斷臨床腫瘤中被廣泛應(yīng)用，檢測(cè)兩者的方法主要包括IRMA（免疫放射分析）法、RIA（放射免疫分析） 、 EIA（固相酶聯(lián)免疫測(cè)定）法等[1-2]。癌癥是威脅者全人類健康的一種疾病，檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物在臨床診斷癌癥與康復(fù)評(píng)估患者病情中發(fā)揮中重要作用。因?yàn)镃EA特異性分子識(shí)別的選擇性比較高，所以?shī)A心免疫分析法逐漸成為臨床定量分析腫瘤標(biāo)記物的關(guān)鍵檢測(cè)方式。免疫傳感器具有較好選擇性、較高靈敏性，而且便于操作，結(jié)合其它轉(zhuǎn)能器后發(fā)展更為迅猛[2]。多種標(biāo)記物模式區(qū)間分辨模式采用夾心免疫分析法的研究報(bào)道也比較多?；瘜W(xué)發(fā)光（CL）的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快、靈敏度比較高、裝置簡(jiǎn)單以及選擇性好等，目前已被廣泛應(yīng)用于多組分分析中。例如，杜平等[3-4]學(xué)者聯(lián)用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和芯片技術(shù)，能夠平行檢測(cè)人體血清中的CA15-3、CA125、AFP、CEA及PSA等腫瘤標(biāo)記物，用于檢測(cè)數(shù)千名癌癥患者的血清，其綜合靈敏度高達(dá)71.2%。林潔華[5]等在多組分腫瘤標(biāo)記物中應(yīng)用底物區(qū)帶分辨技術(shù)進(jìn)行連續(xù)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并以CEA、AFP等為目標(biāo)分析物，抗體捕獲固體化膜材料為聚醚噻吩，創(chuàng)建以雙通道分辨技術(shù)為基礎(chǔ)的流通式免疫分析機(jī)制，對(duì)CEA、AFP進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)的檢出限分別是0.25μg/L、1.5μg/L[6-11]。本研究 對(duì)CEA、AFP兩組分腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行CL-EIA（化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法），免疫反應(yīng)器分別是被了CEA單克隆抗體與AFP單克隆抗體的在醫(yī)院中比較常見(jiàn)的微孔板。采用夾心式免疫分析法與流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的方式，在串聯(lián)可移動(dòng)免疫流通檢測(cè)池中對(duì)CEA、AFP進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。本研究主要對(duì)夾心免疫分析法創(chuàng)建檢測(cè)癌胚抗原與甲胎蛋白的高靈敏肝微粒子酶促化學(xué)發(fā)光作一綜述。

2實(shí)驗(yàn)研究

2.1檢測(cè)儀器及檢測(cè)試劑

本研究的檢測(cè)裝置為可移動(dòng)自制檢測(cè)池、固定單克隆抗體微型檢測(cè)池各2個(gè)，系統(tǒng)管道流路材料為1.0mm內(nèi)徑的硅膠管與0.8mm內(nèi)徑的聚四氟乙烯管。通過(guò)美國(guó)貝克曼化學(xué)發(fā)光儀對(duì)自微型檢測(cè)池中所映射的化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，光路開(kāi)關(guān)為微型檢測(cè)池內(nèi)部不透光部分，與分光光度計(jì)拉桿較為類似，拉動(dòng)微型檢測(cè)池，確保不同微型檢測(cè)池能夠在化學(xué)發(fā)光分析儀電倍增管之上，對(duì)微型檢測(cè)池發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)[12-15]。CEA與AFP診斷試劑盒包含濃度不同的很多標(biāo)準(zhǔn)抗原、預(yù)先固定單克隆抗體的微型檢測(cè)池和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。由上?；瘜W(xué)試劑廠提供的二氧化氫與德國(guó)生產(chǎn)的魯米諾，以二次蒸餾水為實(shí)驗(yàn)用水[16-18]。

2.2夾心免疫分析法

單通道分離檢測(cè)CEA、AFP的流程如圖1所示，除了切換微型檢測(cè)池與手動(dòng)控制可移動(dòng)檢測(cè)池床的光路開(kāi)關(guān)，其它步驟都是電腦自動(dòng)控制。第一步，將泵P2開(kāi)動(dòng)，CEA、AFP混合樣品由管路d泵向進(jìn)樣閥e流入，以此完成采樣，切換進(jìn)樣閥e至載液管路c，載液管路c將混合樣品500μL輸送至微型檢測(cè)池中[19-20]，同時(shí)進(jìn)行40min的停留孵育，確保閥e的閥位保持不變，通過(guò)載液管 c中的載液對(duì)微型檢測(cè)池進(jìn)行3min的沖洗，對(duì)閥e位加以切換，再由管路d將混合抗體泵入，通過(guò)進(jìn)樣閥e采集500μL的樣品，由管理c載液帶入檢測(cè)池，進(jìn)行20min的停留孵育，用微型檢測(cè)池固定酶標(biāo)抗體與混合樣品以完成夾心免疫分析反應(yīng)。各微型檢測(cè)池的體積在250μL左右[21-22]。通過(guò)管路c中的PB（0.1mol/L）對(duì)微型沖洗池進(jìn)行3min的沖洗，之后開(kāi)動(dòng)泵1，通過(guò)管理b、a混合二氧化氫與魯米諾溶液，注入溶液在微型檢測(cè)池中，拉動(dòng)檢測(cè)池拉桿，對(duì)光路開(kāi)關(guān)進(jìn)行控制，放檢測(cè)池在貝克曼化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)窗口之上，以此對(duì)微型池中的酶促化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

3結(jié)果

3.1 CEA、AFP的免疫分析

最佳研究條件下，CEA、AFP的免疫分析曲線見(jiàn)圖2，檢測(cè)CEA、AFP的線性范圍是1.25～40.0μg/L、1.25～50.0μg/L，其相關(guān)系數(shù)分別是0.999、0.998，檢出限分別是1.00μg/L、1.06μg/L，ELISA免疫分析試劑盒診斷指標(biāo)是5.0μg/L、25.0μg/L，因此本研究的免疫傳感器系統(tǒng)具有非常高的靈敏度，滿足應(yīng)用需求，血清腫瘤樣品含量比較高，可通過(guò)0.1mol/LPBS加以稀釋后方可檢測(cè)。

圖2：CEA、AFP的免疫分析曲線

3.2交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)

多重免疫分析中需要考慮的一個(gè)重要因素就是交叉反應(yīng)。本研究中，由于CEA、AFP在分離通道中檢測(cè)，因此，能夠避免反應(yīng)物擴(kuò)散效應(yīng)所產(chǎn)生的交叉干擾。而腫瘤標(biāo)記物與抗體的交叉反應(yīng)時(shí)對(duì)多重免疫反應(yīng)可靠性產(chǎn)生影響的唯一因素。為對(duì)CEA、AFP的交叉反應(yīng)進(jìn)行研究，將CEA添加在AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液中，并和HRP-anti- AFP進(jìn)行孵化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)只提升1.5%，并沒(méi)有影響到AFP測(cè)定。所以，在單次實(shí)驗(yàn)中，兩種腫瘤標(biāo)記物能夠同時(shí)檢測(cè)，而且具有非常小的交叉反應(yīng)。

3.3重現(xiàn)性與精密度

平行實(shí)驗(yàn)是通過(guò)檢測(cè)池與載流沖洗管路對(duì)固定化抗體微孔板進(jìn)行更換后，通過(guò)濃度相同的CEA、AFP進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定，9次重復(fù)試驗(yàn)后發(fā)光強(qiáng)度并未出現(xiàn)明顯改變。CEA、AFP標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%、2.3%，由此可見(jiàn)，該實(shí)驗(yàn)具有非常好的重現(xiàn)性與精密性。

4討論

傳統(tǒng)超微量免疫分析的不足之處在于缺乏穩(wěn)定性，無(wú)法滿足臨床需要[23]。因?yàn)楸４鏃l件苛刻、放射性同位素示蹤劑衰變、自分解變形失活等相關(guān)因素，所以在檢測(cè)單樣品時(shí)，通常要做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其當(dāng)作測(cè)量的重要依據(jù)。實(shí)際上可以在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光免疫分析體系屬于吖啶酯標(biāo)記的發(fā)光、魯米諾-H2O2-HRP與乙烷衍生物，吖啶酯體系屬于Ciba-corning專利產(chǎn)品，其主要優(yōu)勢(shì)在于具有較高靈敏度，但是具有較短的發(fā)光時(shí)間與較差的重復(fù)性，加樣需要原位注射，具有較高的貝克曼化學(xué)發(fā)光儀自動(dòng)化程度要求。HRP具有價(jià)格便宜、活性高、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，所以在酶免疫分析中應(yīng)用最為廣泛，但是魯米諾具有不穩(wěn)定性，很容易氧化發(fā)光，造成所檢測(cè)的特異性與靈敏度不夠理想，二氧乙烷衍生物-堿性磷酸酶發(fā)光體系是目前最為靈敏的發(fā)光分析系統(tǒng)，在檢測(cè)標(biāo)示物ALP限度方面達(dá)到10-21mol。然而，因?yàn)楦叽続LP價(jià)格比較昂貴，螺旋金剛烷發(fā)光底物供應(yīng)渠道不產(chǎn)，高質(zhì)量國(guó)產(chǎn)低成本的雌性微珠缺乏等因素，導(dǎo)致該先進(jìn)技術(shù)很難國(guó)產(chǎn)化。由于EIA方法學(xué)因素，所以無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全定量[24-28]。而基于夾心免疫分析法創(chuàng)建對(duì)癌胚抗原與甲胎蛋白進(jìn)行檢測(cè)具有非常高的靈敏度，而且在單次實(shí)驗(yàn)中，兩種腫瘤標(biāo)記物能夠同時(shí)檢測(cè)，而且具有非常小的交叉反應(yīng)。因此該方法值得在相關(guān)癌癥病理學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用與推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜麗.基于電聚合硫堇膜的電化學(xué)免疫傳感器的研制及應(yīng)用研究[D].青島科技大學(xué)，2010.DOI：10.7666/d.y1740451.

[2] 敖麗梅.納米金粒子的制備及其在免疫分析中的應(yīng)用[D].上海交通大學(xué)，2005.

[3] 杜平.3，4-二氨基苯甲酸-H<，2>O<，2>-HRP伏安聯(lián)免疫分析新體系的研究及在免疫分析中的應(yīng)用[D].青島科技大學(xué)，2006.

[4] Chen， X.，Jia， X.，Han， J. et al.Electrochemical immunosensor for simultaneous detection of multiplex cancer biomarkers based on graphene nanocomposites[J].Biosensors &； Bioelectronics： The International Journal for the Professional Involved with Research， Technology and Applications of Biosensers and Related Devices，2013，50：356-361.

[5] 林潔華，張慧，梅振華等.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光同時(shí)檢測(cè)甲胎蛋白和癌胚抗原[J].分析化學(xué)，2010，38（7）：924-928.

[6] 徐華筠.基于導(dǎo)電聚合物膜的電化學(xué)免疫傳感器的研究[D].青島科技大學(xué)，2010.

[7] Wenqiang Lai，Junyang Zhuang，Juan Tang et al.One-step electrochemical immunosensing for simultaneous detection of two biomarkers using thionine and ferrocene as distinguishable signal tags[J].Mikrochimica Acta： An International Journal for Physical and Chemical Methods of Analysis，2012，178（3/4）：357-365.

[8] 楊鳳愛(ài)，吳修宇，利定建等.自制AFP/CEA雙標(biāo)記TRFIA試劑臨床應(yīng)用效果觀察[J].山東醫(yī)藥，2012，52（38）：27-29.

[9] 趙運(yùn)勝，崔辰瑩，張麗娜等.血清GP73聯(lián)合AFP、CEA及FER檢測(cè)在肝癌診斷中的臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（20）：3465-3467.

[10] 潘麗蘭.血清CEA、CA199、CA125、CA153、AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷價(jià)值[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（12）：2192-2195.

[11] 林潔華，張慧慧，楚鵬飛等.基于氧化石墨烯信號(hào)放大的化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)甲胎蛋白和癌胚抗原[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2012，70（22）：2372-2376.

[12] 訾全生.癌胚抗原聯(lián)合甲胎蛋白檢測(cè)在肝癌鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2013，8（21）：41-42.

[13] Xinle Jia，Xia Chen，Jingman Han et al.Triple signal amplification using gold nanoparticles， bienzyme and platinum nanoparticles functionalized graphene as enhancers for simultane

ous multiple electrochemical immunoassay[J].Biosensors &； Bioelectronics： The International Journal for the Professional Involved with Research， Technology and Applications of Biosens-

ers and Related Devices，2014，53：65-70.

[14] 薛恒，饒冬東，陳登鍇等.國(guó)產(chǎn)洪誠(chéng)免疫分析系統(tǒng)與雅培ARTITECT i2000SR分析系統(tǒng)對(duì)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的比較分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（31）：92-94.DOI：10.3969/ j.issn.1674-

4721.2012.31.046.

[15] 杜葉平，苗晉華，武春梅等.聯(lián)合檢測(cè)CEA、AFP、CA19-9及CA125在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的診斷意義[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2013，40（21）：38-40.

[16] 魯向峰，趙福鑫.甲胎蛋白（AFP）及癌胚抗原（CEA）檢測(cè)在健康體檢中的應(yīng)用[J].中外健康文摘，2013，（21）：197-197.

[17] 岳志剛，熊祝嘉，王曉巖等.腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2013，16（4）：549-551.

[18] Mei-Sheng Wu，Hai-Wei Shi，Li-Jing He et al.Microchip Device with 64-Site Electrode Array for Multiplexed Immunoassay of Cell Surface Antigens Based on Electrochemiluminescence Resonance Energy Transfer[J].Analytical chemistry，2012，84（9）：

4207-4213.

[19] 曹紅，王鵬舉.癌胚抗原聯(lián)合甲胎蛋白檢測(cè)在肝癌鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，19（3）：387-389.

[20] 李慶.CA125、AFP和CEA聯(lián)合檢測(cè)在卵巢癌診斷中的應(yīng)用[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2012，19（4）：216-218.

[21] 馬紅霞，曹偉娟，張雪梅等.羅氏E170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀剩余試劑再利用結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（3）：206-209.

[22] Tian， J.，Zhou， L.，Zhao， Y. et al.Multiplexed detection of tumor markers with multicolor quantum dots based on fluorescen-

ce polarization immunoassay[J].Talanta： The International Journal of Pure and Applied Analytical Chemistry，2012，92：72-77.

[23] 王征，李來(lái)慶，楊鳳愛(ài)等.AFP/CEA雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的研制及性能鑒定[J].山東醫(yī)藥，2010，50（34）：

17-19.

[24] 夏長(zhǎng)勝，樊春紅，楊鐵生等.正常人群血清甲胎蛋白和癌胚抗原參考范圍的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（8）： 1417-

1421.

[25] 任曲，李沛軒，王紅等.AFP和CEA在兩種化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的比對(duì)研究[J].標(biāo)記免疫分析與臨床， 2013，20（3）：

182-184.

[26] 姜曉.癌胚抗原血清糖類抗原CA125和甲胎蛋白聯(lián)合檢測(cè)在卵巢惡性疾病診斷中的意義[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2012，39

（13）：100-101.

[27] 趙艷.青海（西寧）地區(qū)AFP陰性肝癌患者血清中AFU、CEA、CA19-9、SF聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義[D].青海大學(xué)，2012.

[28] Guo， Z.，Hao， T.，Du， S. et al.Multiplex electrochemilumi

nescence immunoassay of two tumor markers using multicolor quantum dots as labels and graphene asconductingbridge[J]. Bios

ensors &； Bioelectronics： The International Journal for the Professional Involved with Research， Technology and Applications of Biosensers and Related Devices， 2013， 44：

101-107.