連燕娜，郭淑琴，周綺云，高兆蘭，王　 海，高麗萍*（北京聯(lián)合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京　 100083）

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EGCG對順鉑損傷HEK293細胞及殺傷A549細胞的影響

連燕娜，郭淑琴，周綺云，高兆蘭，王 海，高麗萍*
（北京聯(lián)合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100083）

【摘要】目的： 探討表兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對順鉑(DDP)致人胚腎HEK293細胞損傷及對DDP殺傷人肺癌A549細胞的影響。方法：體外培養(yǎng)HEK293細胞和A549細胞，分為對照組、DDP組和DDP+EGCG組，DDP組和DDP+EGCG組同時建立DDP損傷模型，MTT法檢測EGCG和/或DDP對HEK293細胞和A549細胞存活率的影響。結果：EGCG對HEK293細胞的IC50值為61.6 mg/L。當EGCG濃度<40 mg/L時，對DDP誘導的HEK293細胞損傷沒有顯著性影響，EGCG濃度≥40 mg/L時，可顯著性增強DDP對HEK293細胞的損傷作用。EGCG對A549細胞的IC50值為33.6 mg/L。當EGCG濃度≥32 mg/L時，可顯著增強DDP對A549細胞的殺傷作用。結論：EGCG對DDP所致HEK293細胞損傷無保護作用，但EGCG對癌細胞毒性作用大于其對正常細胞的毒性，且當EGCG與DDP同時使用時可以加重A549細胞損傷。

【關鍵詞】表兒茶素沒食子酸酯；順鉑；腎毒性；抗腫瘤

作者信息： 連燕娜，E-mail：lianyanna2009@sina.com。*通信作者，高麗萍，E-mail：gaolip62@163.com

Effects of epigallocatechin gallate on cisplatin-induced cytotoxicity in HEK293 and A549 cell lines

LIAN Yanna，GUO Shuqin，ZHOU Qiyun，GAO Zhaolan，WANG Hai，GAO Liping*
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biologically Active Substances and Functional Food, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the effects of epigallocatechin gallate (EGCG) on cisplatin (DDP)-induced cytotoxicity in human embryo kidney (HEK) 293 cells and A549 cells. METHODS：HEK293 cells and A549 cells were cultured in vitro，and effects of DDP and EGCG on HEK293 cells and A549 cells were observed by MTT. The cells were divided into control group，DDP group and DDP+EGCG group. Then，the rates of HEK293 and A549 cell death were investigated by MTT. RESULTS：The IC50of EGCG on HEK293 cells was 61.6 mg/L. At lower than 40 mg/L，EGCG had no significantly effects on DDP-induced HEK239 cell death. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced HEK239 cell death. The IC50of EGCG on A549 cells was 33.6 mg/L. At higher than 40 mg/L，EGCG significantly enhanced DDP-induced A549 cell death. CONCLUSION：EGCG had no significant protective effects on DDP-induced HEK239 cell death，but EGCG induced more cytotoxicity on cancer cells than on normal cells. When co-treated with DDP，A549 cell s ustained m ore damage than H EK239 c ells.

【KEY WORDS】epigallocatechin gallate；cisplatin；nephrotoxicity；anticancer

順鉑[cis-dichlorodiamineplatinum(II)，DDP]是一種廣泛應用的抗癌藥物，臨床上應用于多種癌癥的治療，如肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胸腺癌等[1-4]。DDP在體內(nèi)主要經(jīng)腎臟排泄，在腎臟內(nèi)聚集濃度最高，腎毒性也是限制DDP臨床大量應用的主要因素之一。近年來，在DDP的結構基礎上，合成了大量的DDP類似物，進行抗腫瘤活性篩選，最終有30個左右化合物進入了臨床試驗階段，但在抗癌活性和副作用的綜合評價上均未超過DDP，更不能取代[5]。因此，增強DDP抗癌效果，降低DDP毒副作用就成為目前藥理學、毒理學和腫瘤臨床治療關注的熱點。兒茶素類物質又稱茶單寧，是茶葉茶多酚中的重要活性成分之一，主要包括兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)等，其中EGCG是茶多酚中含量最高、活性最強的單體[6]。研究顯示兒茶素類物質具有抗菌、抗炎、防癌抗癌、抗氧化、保肝等多種生物活性[7-9]，現(xiàn)已引起國內(nèi)外研究者的普遍重視。但兒茶素類物質對DDP所致腎毒性是否有保護作用，對DDP抗癌效果是否有影響均尚未見報道。本研究采用體外細胞培養(yǎng)法探討了EGCG對DDP致人胚腎HEK293細胞損傷的保護作用以及對DDP體外殺傷人肺癌A549細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚腎細胞(HEK293)和人肺腺癌細胞(A549)均購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院細胞中心。DDP(批號406022CF)，注射用凍干粉劑，購自齊魯制藥有限公司；EGCG，純度大于98%(高效液相色譜法檢測)，購自北京金寶在線科技有限公司；0.25%胰酶和DMEM培養(yǎng)基，購自美國Genview公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；四甲基噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，購自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HEK293細胞和A549細胞，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至匯合度為70%~80%時傳代并接種于新培養(yǎng)瓶中，取處于指數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測DDP對HEK293和A549細胞的毒性作用 將處于生長期的細胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細胞生長至匯合狀態(tài)時，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同終濃度DDP的無血清DMEM培養(yǎng)基，HEK293細胞DDP濃度分別為0、2、4、8、16、32、40、60 mg/mL，A549細胞DDP濃度分別為0、5、7.5、10、15、20、25、30 mg/mL，每組設6個復孔，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后MTT法測定細胞抑制率。

1.2.3 MTT法檢測EGCG對HEK293和A549細胞存活率的影響 將處于生長期的細胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細胞生長至匯合狀態(tài)時，棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含不同終質量濃度的EGCG(0、2、4、8、16、32、40、50、60 mg/mL)的無血清DMEM培養(yǎng)基，每組設6個復孔，在 37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后MTT法測定細胞存活率。

1.2.4 MTT法檢測EGCG對DDP致HEK293和A549細胞損傷的影響 將處于生長期的細胞按1×105/mL接種到96孔板中，待細胞生長至匯合狀態(tài)時，加藥處理。試驗分3組：對照組，未加入DDP和EGCG；DDP組，HEK293細胞采用濃度為20 mg/L的DDP處理24 h， A549細胞采用濃度為10 mg/L的DDP處理24 h； DDP+EGCG組，在加DDP前4 h加入不同濃度EGCG孵育細胞，HEK293細胞EGCG濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/mL，A549細胞EGCG濃度分別為2、4、8、16、32、40、50、60 mg/mL。不加藥的組在加藥時加入相應量的溶劑作為對照。每組設6個復孔，在37 ℃、含5% CO2的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測定細胞存活率。

1.2.5 MTT法測定HEK293和A549細胞存活率 細胞經(jīng)藥物處理24 h后，向培養(yǎng)基中加入 MTT，使終質量濃度為0.5 g/L，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清并加入DMSO(每孔100 μL)，混勻10 min，用酶標儀檢測(測定波長570 nm，參比波長630 nm)吸光度值D(570)。細胞存活率=試驗組D(570)值/對照組D(570)值。細胞抑制率=(1-細胞存活率)× 100%。

1.3 統(tǒng)計學方-法

結果以x±s標準差的形式表示，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，對照組、DDP組和DDP+EGCG組細胞存活率間差異的分析采用單因素方差分析和S-NK法，以α=0.05為檢驗水準，用EXCEL軟件作圖。

2 結 果

2.1 EGCG對HEK293細胞的作用

2.1.1 DDP對HEK293細胞的毒性 如圖1所示，隨著DDP濃度增高，對HEK293細胞的抑制率逐漸升高。當DDP濃度為60 mg/L，所測細胞抑制率達到最高，即抑制率為85%±3%。通過SPSS軟件得出DDP對HEK293細胞的IC50值為18.78 mg/L，選用整數(shù)20 mg/L作為建立HEK293細胞DDP損傷模型的濃度。

2.1.2 EGCG對HEK293細胞存活率的影響 如圖2所示，EGCG濃度低于40 mg/L時，對HEK293細胞存活率沒有顯著性影響，而隨EGCG濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，當EGCG濃度高于50 mg/L時，細胞存活率顯著低于空白對照組(P<0.05)。通過SPSS軟件得出EGCG對HEK293細胞的IC50值為61.6 mg/L。

2.1.3 EGCG對DDP致HEK293細胞損傷的影響 如圖3所示，當EGCG濃度較低，即低于20 mg/L時，EGCG對DDP所致的HEK293細胞損傷無明顯的保護作用。當EGCG濃度≥40 mg/L時，HEK293細胞存活率顯著低于DDP損傷組(P<0.05)，可能是因為EGCG高于一定濃度后，其本身就對細胞有一定的毒性，所以更加重了DDP對細胞的損傷。

與對照組比較，*P<0.05.圖1 DDP對HEK293細胞的毒性作用(n=5)

與對照組比較，*P<0.05.圖2 不同濃度EGCG對HEK293細胞存活率的影響(n=5)

與對照組比較，*P<0.05；與DDP模型組比較，#P<0.05.圖3 不同濃度EGCG對DDP誘導HEK293細胞損傷的影響(n=5)

2.2 EGCG對A549細胞的作用

2.2.1 DDP對A549細胞的殺傷作用 如圖4所示，隨著DDP濃度增高，對A549細胞的抑制率逐漸升高。當DDP濃度為30 mg/L，所測細胞抑制率達到最高，即抑制率為85%±4%。DDP對A549細胞的IC50值為10.68 mg/L，因此選用10 mg/L作為建立A549細胞DDP損傷模型的濃度。

與對照組比較，*P<0.05.圖4 DDP對A549細胞的抑制作用(n=5)

2.2.2 EGCG對A549細胞存活率的影響 如圖5所示，EGCG可以顯著抑制A549細胞的增殖(P<0.05)， 且隨著EGCG濃度的增大，A549細胞存活率逐漸降低。說明細胞增殖抑制率與EGCG的濃度存在濃度效應關系。EGCG對A549細胞的IC50值為33.65 mg/L，提示EGCG可能具有很好的抗癌效果。

與對照組比較，*P<0.05.圖5 EGCG對A549細胞存活率的影響(n=5)

2.2.3 EGCG對DDP殺傷A549細胞的影響 如圖6所示，用終濃度為10 mg/L的DDP建立A549細胞損傷模型，當EGCG濃度為2~16 mg/L時，與DDP處理組比較，A549細胞存活率無明顯差異(P>0.05)，當EGCG濃度≥32 mg/L時，A549細胞存活率顯著低于DDP損傷組(P<0.05)，且隨EGCG濃度的增大，細胞存活率逐漸降低，說明EGCG高于一定濃度后可以加重DDP對A549細胞的殺傷作用。

與對照組比較，*P<0.05；與DDP模型組比較，#P<0.05.圖6 EGCG對DDP殺傷A549細胞的影響(n=5)

3 討 論

DDP是臨床上廣泛應用的一種抗腫瘤藥物，由于DDP進入機體后主要通過腎臟排泄，所以其腎毒性最為明顯。DDP在腎臟組織中高濃度分布和長時間蓄積是其腎毒性的作用基礎。DDP中的重金屬離子Pt2+，易于和蛋白質、酶等生物分子中的巰基(-SH)結合，從而使蛋白質和酶失活，使人體組織或細胞受到損傷[10]。另外DDP進入細胞后，氯離子會很快被水分子取代，DDP被水化后形成親電子的活化形式，可以產(chǎn)生大量自由基和活性氧簇(ROS)，從而誘發(fā)機體產(chǎn)生氧化應激反應，損傷線粒體。前期研究表明，氧化應激和線粒體損傷是DDP所致腎損傷的主要因素之一[11]。并且細胞中大量的自由基和ROS可以激活內(nèi)源性細胞凋亡信號通路，最終導致細胞凋亡[12]。由此可見，DDP在腎組織中引起的損傷可能是多靶位，多方向的。

EGCG是綠茶中茶多酚的主要活性物質，大量的實驗研究表明，EGCG具有很強的抗氧化和抗炎癥作用[13]，并且EGCG通過其抗炎、抗氧化的效應對改善腎臟炎癥、組織損傷和腎功能方面有著一定的作用[14]。本研究結果顯示EGCG對DDP所致HEK293細胞損傷沒有顯著性的保護作用，可能是因為DDP引起的細胞損傷是多靶位的，而EGCG的抗氧化作用不足以保護DDP誘導的細胞損傷。

近年來，隨著研究的深入，DDP抗腫瘤作用的機制越來越清楚。持續(xù)性分裂是癌細胞的主要特征之一。DDP進入細胞后，氯離子會很快被水分子取代，DDP被水化后形成親電子的活化形式?；罨腄DP可與核酸分子上的巰基或嘌呤堿基的N7供氮活性中心反應，形成鏈內(nèi)或鏈間加合產(chǎn)物，從而造成癌細胞的DNA損傷，阻止細胞分裂，最終導致癌細胞凋亡[15]。另外，DDP可以改變癌細胞內(nèi)多種信號通路，如MAPK信號通路、AKT信號通路、JNK信號通路以及Caspase信號通路等，這些信號通路的改變都將最終導致細胞凋亡[16]。

研究證實，EGCG對肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤均有抗腫瘤作用[17]。EGCG可以通過提高凋亡相關蛋白的活性抑制癌細胞增殖，促進細胞凋亡[18]。本研究結果表明，EGCG有一定的細胞毒性作用，因此，EGCG的抗腫瘤作用可作進一步研究，尤其是與化療藥物的協(xié)同作用。另外，一定濃度的EGCG與DDP共同作用可以增強A549細胞的損傷，此結果與Zhang等[19]的研究結果是一致的，其結果顯示EGCG可以通過改變基因的甲基化狀態(tài)來增強癌細胞對DDP的敏感性。也有研究表明，EGCG與其他抗癌藥物聯(lián)合使用可以增強MAPK信號通路介導的細胞凋亡相關基因的表達[10]。因此，EGCG增強DDP抗癌效果的確切機制還有待于進一步研究。

參考文獻

[1] Abrams TJ，Lee LB，Murray LJ，et al. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer[J]. Mol Cancer Ther，2003，2(5)：471-478.

[2] Maurmann L，Belkacemi L，Adams NR，et al. A novel cisplatin mediated apoptosis pathway is associated with acid sphingomyelinase and FAS proapoptotic protein activation in ovarian cancer[J]. Apoptosis，2015，20(7)：960-974.

[3] Chau C，Wheater M，Geldart T，et al. Clinical outcomes following neoadjuvant cisplatin-based chemotherapy for bladder cancer in elderly compared with younger patients[J]. Eur J Cancer Care (Engl)，2015，24(2)：155-162.

[4] Prabhakaran P，Hassiotou F，Blancafort P，et al. Cisplatin induces differentiation of breast cancer cells[J]. Front Oncol，2013，3：134.

[5] Rodriguez-Fernandez E，Manzano JL，Alonso A，et al. Fluorescent cisplatin analogues and cytotoxic activity[J]. Curr Med Chem，2009，16(32)：4314-4327.

[6] 熊立瑰，劉仲華，黃建安. 茶兒茶素研究進展[J]. 茶葉通訊，2011，38(1)：27-31.

[7] Muller P，Downard KM. Catechin inhibition of influenza neuraminidase and its molecular basis with mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal，2015，111：222-230.

[8] Kobayashi H，Tanaka Y，Asagiri K，et al. The antioxidant effect of green tea catechin ameliorates experimental liver injury [J]. Phytomedicine，2010，17(3/4)：197-202.

[9] Cueno ME，Tamura M，Ochiai K. Middle-aged rats orally supplemented with gel-encapsulated catechin favorably increases blood cytosolic NADPH levels[J]. Phytomedicine，2015，22(4)：425-430.

[10] Suganuma M，Saha A，F(xiàn)ujiki H. New cancer treatment strategy using combination of green tea catechins and anticancer drugs[J]. Cancer Sci，2011，102(2)：317-323.

[11] 趙艷萌，趙江燕，高麗萍. 葡萄籽原花青素對順鉑所致大鼠腎臟氧化損傷和線粒體損傷的防護作用[J]. 現(xiàn)代食品科技，2015，31(1)：6-10.

[12] Santos NA，Catao CS，Martins NM，et al. Cisplatin-induced nephrotoxicity is associated with oxidative stress，redox state unbalance，impairment of energetic metabolism and apoptosis in rat kidney mitochondria[J]. Arch Toxicol，2007，81(7)：495-504.

[13] Hu J，Zhou D，Chen Y. Preparation and antioxidant activity of green tea extract enriched in epigallocatechin (EGC) and epigallocatechin gallate (EGCG)[J]. J Agric Food Chem，2009，57(4)：1349-1353.

[14] 張媛媛，侯衛(wèi)平，袁 發(fā). EGCG對腎臟疾病保護作用的研究進展[J]. 中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2013，14(11)：1022-1024.

[15] Dasari S，Tchounwou PB. Cisplatin in cancer therapy：molecular mechanisms of action[J]. Eur J Pharmacol，2014，740：364-378.

[16] 凌 兵，馮 林，程書鈞. DENND2D通過調(diào)控PARP1對非小細胞肺癌細胞系H1299中順鉑細胞毒性的影響[J]. 癌變·畸變·突變，2013，25(2)：87-90.

[17] 張煥金，蔡林兒. 綠茶提取物茶多酚抗癌作用的研究進展[J]. 華 南國防醫(yī)學雜志，2012，26(5)：522-523.

[18] 吳方紅，周學軍，文 靜. EGCG對大腸癌細胞系LoVo細胞增殖的影響及其機制[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17(1)：3 3-36.

[19] Zhang Y，Wang X，Han L，et al. Green tea polyphenol EGCG reverse cisplatin resistance of A549/DDP cell line through candidate genes demethylation[J]. Biomed Pharmacother， 2015，69：285-290.

基金項目：北京聯(lián)合大學校級科研項目重點實驗室開放課題(Zk70201502)

收稿日期：2015-07-07；

修訂日期：2015-12-21

中圖分類號：Q946.8

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0014-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.003