□陳小芳 廣州市增城質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)所

乳制品中玉米赤霉醇類藥物殘留檢測(cè)
——液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

□陳小芳 廣州市增城質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)所

通過(guò)此次研究得到了較好的測(cè)乳制品中玉米赤霉醇類藥物殘留的高效、準(zhǔn)確的方法。乳制品中的玉米赤霉醇類化合物經(jīng)乙腈提取、正己烷脫脂、過(guò)MAX柱凈化濃縮后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。玉米赤霉醇類化合物在0～10 μg/L內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，方法檢出限為1.0 μg/L,定量限為2.0 μg/L，6種玉米赤霉醇類化合物的平均回收率為99.5%～105.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%～14.88%。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度高，用于乳制品中玉米赤霉醇類化合物的測(cè)定，可獲得滿意的結(jié)果。

乳制品；玉米赤霉醇類；液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法

1 玉米赤霉醇類化合物簡(jiǎn)介

玉米赤霉醇類化合物的殘留問(wèn)題曾經(jīng)多次出現(xiàn)在公眾視線，例如玉米赤霉醇作為牛羊促長(zhǎng)劑，以耳根埋植的形式應(yīng)用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高酮體瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率。但玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在動(dòng)物尿液中的殘留會(huì)引起機(jī)體性機(jī)能的紊亂，影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導(dǎo)下，還可能致癌，且排出動(dòng)物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染和環(huán)境污染[1]。玉米赤霉烯酮具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對(duì)家禽、豬、牛和羊影響較大，給畜牧業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在世界各地各種糧谷和飼料中均有玉米赤霉烯酮存在。對(duì)此，世界多個(gè)國(guó)家都出臺(tái)相關(guān)政策，嚴(yán)格控制玉米赤霉醇類藥物的殘留限量[2]。另?yè)?jù)《中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào)》報(bào)道，我國(guó)農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司已向各省區(qū)市畜牧主管部門(mén)發(fā)出通知，嚴(yán)禁玉米赤霉醇（又名畜大壯、牛羊增重劑）埋植劑用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。研究玉米赤霉醇類藥物殘留任重道遠(yuǎn)，此文研究的玉米赤霉醇類化合物有α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮。α—玉米赤霉醇是玉米赤霉烯醇的衍生物，而玉米赤霉烯酮的衍生物有α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇。玉米赤霉烯酮溶于堿性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和醇類溶劑，微溶于石油醚，不溶于水[3]。玉米赤霉醇，溶于堿性水溶液、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇等有機(jī)溶劑，微溶于石油醚。

目前，玉米赤霉醇的測(cè)定方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（EIA）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和高效液相色譜—紫外檢測(cè)法（HPLC-UA）等[4]。玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法大致分為化學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)方法[5]，化學(xué)檢測(cè)方法包括薄層色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法和液譜—質(zhì)譜聯(lián)用法；免疫學(xué)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和免疫膠體金快速診斷技術(shù)。但因?yàn)槊糠N方法均有一定的局限性，綜合了液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)缺點(diǎn)后，本文選用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定目標(biāo)物。

樣品的提取和凈化方法通常采用液-液分配和以氨基、C18、氧化鋁為固相萃取預(yù)柱的SPE方法，這些方法大多操作繁瑣耗時(shí)，而且需要大量的有機(jī)溶劑, 在回收率、準(zhǔn)確度和精密度等方面都難以取得理想的效果[6]。本實(shí)驗(yàn)采用MAX固相萃取柱進(jìn)行凈化濃縮，可得到較為理想的效果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

2.2.1 試劑

甲醇，正己烷，乙腈，乙酸乙酯，氫氧化鈉，水硫酸鈉，氨水。

甲醇-氨水-水：準(zhǔn)確量取甲醇5 mL、氨水5 mL、水90 mL，混勻。

2%乙酸乙腈：移取2 mL乙酸，量取98 mL乙腈，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：精確取適量的α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，用甲醇分別配成濃度為100 μg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL的α—玉米赤霉醇、β—玉米赤霉醇、α—玉米赤霉烯醇、β—玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋定容，-20 ℃冰箱中保存。

以上所用試劑，除特殊注明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

2.2.2 儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源），渦旋振蕩器，水平振蕩器，冷凍高速離心機(jī)，組織勻漿機(jī)，氮吹儀，固相萃取裝置，Oasis MAX固相萃取柱，規(guī)格為60 mg，3 ml。

2.2 材料

新鮮或解凍的牛奶、奶酪、酸奶等乳制品。

2.3 樣品處理

稱取待測(cè)樣品3～7 g于50 mL帶塞離心管中，加入濃度為10 mg/L的內(nèi)標(biāo)50μl，無(wú)水硫酸鈉約2 g和乙腈10.00 mL，用勻質(zhì)器混勻，然后用另一裝有乙腈10 mL的50 mL離心管，洗刀頭，合并兩次提取液。在水平振蕩器上振蕩15～20 min。4000 r/min離心5min。取上清液12 mL于另一大試管中，加正己烷10.00 mL，振蕩5 min，冷凍高速離心機(jī)上離心5min后吸去上清液，余液于50 ℃下吹氮至0.1 mL以下。加水10.00 mL，用3 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至11，4000 r/min離心5 min，待凈化。

2.4 凈化富集

將待凈化液過(guò)MAX固相萃取柱，依次用甲醇-氨水-水1 mL和甲醇0.5 mL淋洗，接著用2%乙酸乙腈4 mL洗脫并收集洗脫液后，于50 ℃下吹干。殘余物加乙腈0.5 mL，渦動(dòng)1 min，加水0.5 mL，混勻后過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜以供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2.5 色譜質(zhì)譜條件

2.5.1 液相色譜參考條件

色譜柱：Sunfire C18柱，100 mm×3.0 mm（i.d.），3 μm；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.02%乙酸水溶液；流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量:10 μL。

梯度洗脫條件見(jiàn)表1。2.5.2 質(zhì)譜參考條件

2.5.2.1 離子源和氣體設(shè)置

負(fù)TurboIonspray電離源（ESI）；霧化氣（NEB）和氣簾氣（CUR）：N2,設(shè)置值分別為10和7；加熱輔助氣：N2,流量8 L/min；離子源溫度（TEM）：500 ℃；電離電壓（IS）：-3 500V；碰撞氣（CAD）：N2,設(shè)置值為10。

2.5.2.2 監(jiān)測(cè)模式和參數(shù)設(shè)置

采用多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)方式（multiple reaction monitoring, MRM）。

Dwell（msec）：100；DP：-70；CXP：-10；FP：-200；EP：-5；其余參數(shù)見(jiàn)表2。

2.5.3 液質(zhì)聯(lián)用的測(cè)定

按表3分別吸取適量的濃度為0.1 mg/L的玉米赤霉醇類標(biāo)準(zhǔn)工作液、1.0 mg/L玉米赤霉醇-D4內(nèi)標(biāo)溶液，流動(dòng)相至液相色譜進(jìn)樣瓶中，混勻備用。臨用前配制。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取與凈化

3.1.1 提取方法的選擇

玉米赤霉醇類化合物極性極高，在樣品的提取階段，應(yīng)選擇具有適當(dāng)極性的提取劑。參考相關(guān)資料可知，通常情況下，選用的提取溶劑有甲醇、乙腈、乙腈水溶液。當(dāng)樣品為牛奶、奶粉等待測(cè)樣時(shí)，通常用乙腈進(jìn)行提取，因此，在本實(shí)驗(yàn)方法選擇乙腈作為提取劑。另外，由于乳制品的粘性較大，均質(zhì)時(shí)不能完全分開(kāi)，甚至大量的樣品黏在均質(zhì)器的刀頭上，為了能使樣品與提取劑充分接觸，本實(shí)驗(yàn)在均質(zhì)前，向樣品中加入約2 g無(wú)水硫酸鈉。另外針對(duì)黃油熔點(diǎn)較低，在28℃左右會(huì)軟化，34 ℃以上就會(huì)液化，在加內(nèi)標(biāo)前，把裝有樣品的離心管置于50 ℃水浴中，使待測(cè)黃油完全熔化后，再按2.3操作。

3.1.2 凈化條件的優(yōu)化

由于乳制品中脂肪含量過(guò)高，過(guò)柱時(shí)容易堵塞柱的孔徑，因此，在通過(guò)固相萃取柱之前，需要加入正己烷，進(jìn)行脫脂處理。

在相關(guān)文獻(xiàn)[7]中可知，動(dòng)物源性食品中玉米赤霉醇類化合物殘留檢測(cè)常應(yīng)用NH2柱（離子交換萃取小柱）或MAX柱（混合型強(qiáng)陰離子柱）。使用500 mg，6 ccNH2柱的結(jié)果比200 mg，3 cc NH2柱得到的結(jié)果要好且較為理想。而應(yīng)用60 mg，3 ccMAX柱得到的結(jié)果就已經(jīng)達(dá)到500 mg，6 cc NH2柱的結(jié)果。鑒于后者價(jià)格較前者價(jià)格昂貴，所以本實(shí)驗(yàn)選用60 mg，3 ccMAX柱進(jìn)行凈化處理。

3.1.3 淋洗液與洗脫液的選擇

在此方法中，分別配備了3種不同濃度的淋洗液和洗脫液，分別為甲醇-氨水-水（5+5+90，v/v/v），甲醇-氨水-水（5+10+85，v/v/v），甲醇-氨水-水（10+5+85，v/v/v）；1%乙酸乙腈，2%乙酸乙腈，3%乙酸乙腈。然后進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1、圖2所示。

因?yàn)橛衩壮嗝勾碱惢衔锏幕厥章蕿?0%～120%，由圖1可知，分別用甲醇-氨水-水（5+10+85，v/v/v），甲醇-氨水-水（10+5+85，v/v/v）作為淋洗液時(shí)，玉米赤霉醇類化合物的回收率均超過(guò)120%，因此淋洗液應(yīng)選擇甲醇-氨水-水（5+5+90，v/v/v）。由圖2可知，1%乙酸乙腈，3%乙酸乙腈作為洗脫液時(shí)，玉米赤霉醇類化合物的平均回收率也是超過(guò)120%，因此應(yīng)該選擇2%乙酸乙腈作為洗脫液。

3.2 線性范圍、檢出限和定量限

用空白樣品制備樣品空白提取液，用該提取液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0、1.0、2.0、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg溶液，各組分的濃度（y，μg/kg）與對(duì)應(yīng)的峰面積（x）比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。該方法測(cè)定乳制品中6種玉米赤霉醇類化合物的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

3.3 回收率與精密度

采用乳制品，如奶油、奶酪、酸奶進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其含量水平分別為1.0、2.0、5.0 μg/L，充分搖勻，使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品混合均勻，按照本實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，其回收率和精密度見(jiàn)表4，表5，表6。

由上表可知，6種玉米赤霉醇類化合物的平均回收率為99.5%～105.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%～14.88%。

4 結(jié)論

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乳制品中玉米赤霉醇類化合物殘留，采用內(nèi)標(biāo)法定量。此法用乙腈作為提取劑，并針對(duì)在提取過(guò)程中樣品不能很好地分離，提取時(shí)加入無(wú)水硫酸鈉并勻質(zhì)處理，乳制品脂肪含量較高，為了不堵塞凈化柱，在過(guò)柱前加入正己烷進(jìn)行脫脂后再過(guò)60 mg 3 ccMAX柱，最后選擇甲醇-氨水-水（5+5+90，v/ v/v）為淋洗液，2%乙酸乙腈為洗脫液，最后用0.5 mL乙腈和0.5 mL水定容，過(guò)0.2 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

該方法的檢出限為1.0 μg/kg。具有特異性強(qiáng)、靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)。經(jīng)多次試驗(yàn)證明，此方法穩(wěn)定、回收率以及精密度可以滿足試驗(yàn)工作的要求。

[1]張曉東,朱葉青,朱惠珍.LCMS/Ms法測(cè)定牛肉中玉米赤霉醇的殘留[J].北京藥學(xué),2008(3):13-15.

[2]龐凌云，祝美云，李瑜.玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2009(7):39-41.

[3]羅小虎.高效液相色譜法測(cè)定玉米赤霉烯酮的方法研究[J].食品科技,2010(1):266-270.

[4]張巖,李揮，張敬軒，等.快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物組織中雌激素玉米赤霉醇類化合物[J].分析化學(xué)，2009,37(11):1683-1686.

[5]王元?jiǎng)P,王君，嚴(yán)亞賢.玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2009,25(9):1100-1101.

[6]孟娟,張晶,張楠，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮類真菌毒素[J].色譜,2010,28(6):604-607.

[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GB/T 22992-2008) [S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.