田新紅，王 琦，尚立芝，韓云志，潘曉麗，郭艷華

(河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008)

柴胡疏肝散對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路的作用及相關(guān)性研究*

田新紅，王 琦，尚立芝△，韓云志，潘曉麗，郭艷華

(河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008)

目的:觀察柴胡疏肝散對(duì)TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路的影響，探索其抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法:50只Wister大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、病理模型組、柴胡疏肝散高、中、低劑量組5組。除正常組外，其余各組均用腹腔注射CCl4制備肝纖維化模型。各治療組于第6周給藥至第10周結(jié)束。免疫組化S-P法檢測(cè)肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制因子TIMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與模型組比較，柴胡疏肝散中劑量組TGF-β1蛋白、p-p38MAPK和α-SMA蛋白表達(dá)顯著減弱，MMP-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，TIMP-1蛋白表達(dá)顯著減弱。結(jié)論:柴胡疏肝散有明顯的抗肝纖維化作用。其機(jī)制可能與柴胡疏肝散經(jīng)TGF-β/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，使HSC低表達(dá)TIMP-1、高表達(dá)MMP-9從而促進(jìn)基質(zhì)降解有關(guān)。

柴胡疏肝散;肝纖維化;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;p38絲裂原活化蛋白激酶;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶

肝纖維化的實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular Matrix，ECM)的過量沉積。柴胡疏肝散載于明·張景岳《景岳全書》，是疏肝理氣法的代表方，具有疏肝解郁之功效，主治肝氣郁滯證。本課題組前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，柴胡疏肝散對(duì)改善肝功能、抗肝纖維化有顯著療效［1-7］，但其作用機(jī)制未明。為探討柴胡疏肝散能否通過阻止基質(zhì)合成，同時(shí)促進(jìn)ECM降解多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝纖維化作用，本研究模擬肝纖維化的中醫(yī)肝郁血瘀病機(jī)，制備大鼠豬血清免疫損傷性肝纖維化模型，觀察柴胡疏肝散對(duì)參與肝纖維化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、p38絲裂原活化蛋白激酶 (motogen-activated protein kinase，p38MAPK)，反映肝星狀細(xì)胞(hepatocellularstellate cell，HSC)活化程度的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA)，以及與基質(zhì)降解有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase，MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitive factor of metalloprote-ase，TIMP-1)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6月齡雄性SPF級(jí)Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(300±20)g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(豫)2012-0001)。

1.2 主要藥品與試劑

柴胡疏肝散組成:柴胡、陳皮、川芎、醋香附各10 g，枳殼、白芍各6 g，炙甘草2 g，以上藥物用三九中藥配方顆粒。兔抗大鼠TGF-β1、p-p38MAPK一抗為武漢BOSTER公司產(chǎn)品(多克隆BA0290、多克隆BA1325)、兔抗大鼠α-SMA一抗為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品(單抗bs-0189R)，兔抗大鼠MMP-9和TIMP-1一抗(多克隆BA0574，多克隆BA0575)、SABC免疫組化染色試劑盒(SA1025)和DAB顯色試劑盒(ED1022)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。CCl4、分析純由鄭州試劑二廠提供。

1.3 主要儀器

PRS-3電子干燥箱(湖北應(yīng)山國(guó)營(yíng)電子元件廠)、VIS-7220型分光光度儀(北京第二光學(xué)儀器廠)、U-CMAD3型OLYMPUS顯微鏡(日本Olympus公司)、顯微攝像儀OLYMPUS(JAPAN 20486)等，OLYMPUSGX51全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、病理模型組、柴胡疏肝散高、中、低劑量組5組各10只，按參考文獻(xiàn)方法制備模型［8］。除正常組外，其余各組均用腹腔注射CCL4制備肝纖維化模型。給予Wistar大鼠腹腔注射0.6ml(按2 ml/kg)40%(v/v)的CCL4(溶于蓖麻油中)，每周2次共10周，5周后即可形成肝纖維化。各治療組于第6周給藥，每天下午6∶00灌胃1次。柴胡疏肝散按高、中、低(3.15 g、6.3 g、12.6 g)/(kg·d)劑量灌胃［3］，模型組給予生理鹽水6.3 ml/(kg·d)灌胃，至第10周結(jié)束。

圖1 各組大鼠肝組織TGF-β1蛋白(IHC ×100)

1.4.2 取材與標(biāo)本制備 取新鮮肝組織左葉2.5 cm×2．0 cm×0.5 cm，各組取材部位基本一致，10%多聚甲醛固定液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚7 μm切片用于HE染色，厚4 μm切片用于免疫組化檢測(cè)。

1.4.3 免疫組化檢測(cè) 免疫組化S-P法檢測(cè)TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9和 TIMP-1蛋白表達(dá)。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2室溫10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，羊血清封閉室溫下20 min，加TGF-β1、pp38MAPK、α-SMA、MMP-9和TIMP-1兔抗大鼠第一抗工作液(稀釋度均為1∶100)，4℃冰箱孵育過夜，加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃濕盒孵育20 min，加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物37℃濕盒孵育20 min，以新鮮配制的DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性的肝細(xì)胞CCl4中毒組織切片作為陽性對(duì)照，以PBS替代一抗作為空白對(duì)照。所有切片均以有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，以不著色為陰性。每張切片隨即選取10個(gè)高倍視野(×400)，采用OLYMPUSGX51全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)陽性染色吸光度(A)，取平均值進(jìn)行分析。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常組皮毛保持光滑亮澤，體格健壯，飲食正常，喜活動(dòng)，善打斗，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，無死亡。模型對(duì)照組皮毛逐漸干枯稀疏，無光澤，精神不振，反應(yīng)遲鈍，身體消瘦，進(jìn)食、排便、活動(dòng)均減少，體質(zhì)量較造模前略有增加，死亡2只。高、中、低治療組大鼠皮毛尚可，有光澤，身體較壯，飲食較正常，活動(dòng)力強(qiáng)，常有打斗，體質(zhì)量增加明顯，高、低劑量治療組各死亡1只。

2.2 肝組織TGF-β1、p-p38MAPK和α-SMA蛋白表達(dá)

TGF-β1、p-p38MAPK蛋白陽性信號(hào)均位于細(xì)胞漿，少量胞漿與胞核共染呈棕黃色。與正常組比較，模型組TGF-β1陽性信號(hào)表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);模型組TGF-β1、p-p38MAPK蛋白陽性細(xì)胞均主要位于血竇處、匯管區(qū)、纖維間隔中(圖1、2)。表1顯示，與模型組比較，柴胡疏肝散中劑量組TGF-β1(P＜0.05)、p-p38MAPK(P＜0.01)蛋白表達(dá)顯著減弱。α-SMA蛋白陽性信號(hào)均位于細(xì)胞漿，少量胞漿與胞核共染呈棕黃色。模型組α-SMA蛋白陽性表達(dá)較正常組顯著(P＜0.05)，主要位于匯管區(qū)、纖維間隔中(圖3);與模型組比較，柴胡疏肝散高、中劑量組α-SMA蛋白表達(dá)顯著減弱(P＜0.01)。

2.3 肝組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)

MMP-9和TIMP-1蛋白陽性信號(hào)均位于細(xì)胞漿，少量胞漿與胞核共染呈棕黃色。正常大鼠肝臟匯管區(qū)及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)均見MMP-9陽性，也可見肝細(xì)胞呈陽性顆粒;模型組MMP-9陽性染色多集中于纖維間隔、中央靜脈周圍、血竇處的間質(zhì)細(xì)胞胞漿。與正常組比較，模型組MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4表1顯示，與模型組比較，柴胡疏肝散高、中劑量MMP-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠肝組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)(IHC×400)

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白(IHC×400)

圖4 各組大鼠肝組織MMP-9蛋白(IHC×400)

圖5 各組大鼠肝組織TIMP-1蛋白(IHC×400)

表1 柴胡疏肝散對(duì)大鼠肝纖維化TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP9和TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響(±s)

表1 柴胡疏肝散對(duì)大鼠肝纖維化TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP9和TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1 TGF-β1 p-p38MAPK α-SMA MMP9 TIMP-1正 常 組 10 — 3.55±0.38 23.01±0.32 3.85±0.83 19.52±1.37 21.24±1.32模 型 組 8 — 12.51±0.372) 88.53±0.372) 12.39±0.521) 39.13±1.51 250.39±3.412)柴胡疏肝散組 9 12.6 6.26±1.541) 61.71±0.421) 8.15±0.471) 78.51±1.472) 95.15±3.352)10 6.3 5.32±1.461) 45.76±0.821) 6.51±0.482) 112.38±1.322) 80.55±2.152)9 3.15 7.28±1.35 52.19±0.361)7.42±0.56 85.21±2.50 135.19±3.72

正常組TIMP-1陽性顆粒主要表達(dá)于匯管區(qū)及血管周圍，肝細(xì)胞呈散在陽性。模型組TIMP-1表達(dá)于匯管區(qū)、纖維間隔，肝細(xì)胞亦呈彌漫陽性，模型組TIMP-1表達(dá)較正常組顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。圖5表1顯示，與模型組比較，柴胡疏肝散高、中劑量TIMP-1蛋白表達(dá)均顯著減弱(P＜0.01)。

2.4 TGF-β1與MMP-9、TIMP-1表達(dá)的相關(guān)性

應(yīng)用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，柴胡疏肝散中劑量組TGF-β1與TIMP-1呈正相關(guān)(r= 0.39，P＜0.05)，TGF-β1與MMP-9呈負(fù)相關(guān)(r=－0.78，P＜0.01)。

4 討論

肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積。慢性肝損害過程中，HSC在炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的改變等多種因素刺激下被激活。TGF-β1通過TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至HSC細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，繼而使HSC進(jìn)一步活化、增殖與遷移［9］?；罨腍SC產(chǎn)生大量的ECM并表達(dá)具有收縮功能的α-SMA，α-SMA的表達(dá)成為HSC激活的標(biāo)志物［10］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，柴胡疏肝散高、中劑量組 TGF-β1pp38MAPK和α-SMA蛋白表達(dá)顯著減弱。模型組及各治療組中TGF-β1與p-p38MAPK蛋白、TGF-β1與α-SMA蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)，提示柴胡疏肝散中劑量可有效減少ECM合成。其機(jī)制可能與阻止TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路、抑制HSC的活化轉(zhuǎn)型、使HSC低表達(dá)α-SMA有關(guān)。

肝纖維化過程中，ECM合成增多、降解減少，致使ECM過度沉積。

與ECM代謝相關(guān)的酶包括MMPs和TIMPs，其在肝纖維化形成和降解的動(dòng)態(tài)平衡過程中起重要作用。研究表明，活化的HSC是MMPs與TIMPs主要的細(xì)胞來源，激活的HSC經(jīng)TGF-β/p38MAPK信號(hào)通路，可使TIMP表達(dá)增強(qiáng)，高表達(dá)的TIMP抑制MMP的活性，使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展［11］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，柴胡疏肝散高、中劑量組肝組織MMP-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，TIMP-1蛋白表達(dá)均顯著減弱，提示柴胡疏肝散中劑量組可促進(jìn)ECM的降解，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。其機(jī)制可能為柴胡疏肝散抑制TIMP-1蛋白表達(dá)，使TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用減弱，從而增強(qiáng)ECM的降解。

中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化的核心病機(jī)是肝氣郁滯，疏肝理氣是逆轉(zhuǎn)肝纖維化演變的最佳手段與措施，柴胡疏肝散則是辨治肝纖維化的合理方藥。該方由柴胡、陳皮、枳殼、香附、川芎、芍藥、炙甘草組成，方中柴胡疏肝解郁為君藥，香附理氣疏肝助柴胡疏肝解郁，川芎行氣活血止痛助柴胡疏肝經(jīng)之郁滯，二藥相合增其行氣止痛之功，共為臣藥;枳殼、陳皮理氣行滯，白芍、甘草養(yǎng)血柔肝、緩急止痛均為佐藥，甘草兼調(diào)諸藥亦為使藥，此方有疏肝理氣兼以健脾通絡(luò)功效。柴胡疏肝散抗肝纖維化，其機(jī)制可能通過干預(yù)TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制HSC活化，阻遏TGF-β1和α-SMA基因表達(dá)，減少基質(zhì)合成，阻止肝纖維化進(jìn)展;同時(shí)抑制 TIMP-1蛋白表達(dá)，使TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用減弱，MMP-9表達(dá)得以增強(qiáng)，高表達(dá)的MMP-9使基質(zhì)降解增加，促使肝纖維化逆轉(zhuǎn)。

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Role and correlation study of Chaihu Shugan powder on signal pathway of TGF-beta 1/p38MAPK in rat hepatic fibrosis

TIAN Xin-hong，WANG Qi，SHANG Li-zhi△，HAN Yun-zhi，PAN Xiao-li，GUO Yan-hua
(Department of Physiology of School of Basic Medicine，Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China)

Objective To observe the effects of Chaihu Shugan Powder on the signaling pathways of TGF-β1/p38MAPK and explore its action mechanism for anti-hepatic fibrosis．Methods 50 Wister rats were randomly divided into five groups: normal control group，pathologic model group，three Chaihu Shugan Powder groups of high dose，mediate dose and low dose respectively．Expect for the normal group，the rats in the rest groups were all made into liver fibrosis models by intraperitoneal injection of CCl4．Each treatment group was given Chaihu Shugan Powder from the 6th week to the 10th week．The expressions of transforming growth factor-β1(TGF-β1)，p38motogen-activated protein kinase(p38MAPK)，αsmooth muscle actin(α-SMA)，matrix metalloproteinase-9(MMP-9)，and tissue inhibitive factor of metalloproteinase (TIMP-1)in hepatic tissue were detected by S-P immunohistochemical method．Result Compared with the model group，the protein expression of TGF-β1，p38MAPK，α-SMA in the Chaihu Shugan Powder group of mediate dose declined markedly，while the expression of the TIMP-1 protein increased significantly and the expression of TIMP-1 protein declined remarkably．Conclusion:Chaihu Shugan Powder has obvious efficacy of anti-hepatic fibrosis．The action mechanism may be related with its inhibition of the hepatic stellate cell(HSC)by the signaling pathway of TGF-β/p38MAPK，which realizes the low expression of TIMP-1，the high expression of MMP-9 and the enhanced matrix degradation．

Chaihu Shugan Powder;hepatic fibrosis;TGF-β1;p38MAPK;α-SMA;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0062-04

2015-05-06

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目(12B360010)

田新紅，副教授，從事經(jīng)方配伍基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者:尚立芝，副教授，從事經(jīng)方配伍基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:lzshang2014@163．com。