孫曉霞，蓋瀟瀟，孫立魁，王賢美，仇士東，侯 麗

(國家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250101)

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重組異種骨對(duì)Balb/c小鼠的免疫學(xué)影響

孫曉霞，蓋瀟瀟，孫立魁，王賢美，仇士東，侯 麗

(國家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250101)

目的 動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)小鼠植入重組異種骨后的免疫毒性改變，揭示該重組異種骨的免疫學(xué)作用機(jī)制。方法 以廣東冠昊生物科技股份有限公司研發(fā)的重組異種骨為材料，進(jìn)行體外檢測(cè)該重組異種骨的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；將重組異種骨植入Balb/c小鼠右側(cè)股部肌間隙，分別通過血生化分析儀、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)，于植入后1周、2周、4周動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Balb/c小鼠免疫學(xué)改變，綜合評(píng)價(jià)該重組異種骨對(duì)機(jī)體的免疫學(xué)影響。結(jié)果 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組異種骨無明顯的體外淋巴細(xì)胞免疫刺激作用；異種骨植入小鼠后，其血清中C3、IgG、IgM、炎性因子(TNF-α、IL-6)水平以及植入物局部堿性磷酸酶(ALP)含量均與陰性對(duì)照組(即假手術(shù)組)無明顯差異，且該異種骨植入對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及其淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的分群和活化均無顯著影響。結(jié)論 該重組異種骨不能引起體內(nèi)外的免疫毒性反應(yīng)，從而為重組異種骨的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

重組異種骨；免疫毒性；Balb/c小鼠

由于事故或疾病等各種原因造成的骨創(chuàng)傷、骨缺損是臨床常見病例。自體骨是目前公認(rèn)的植骨材料[1]，但患者要遭受2次手術(shù)的痛苦，且其數(shù)量有限；此外，異體骨的來源有限且有傳染疾病的危險(xiǎn)。重組異種骨因其來源廣泛和獨(dú)特的生物學(xué)特性作為組織工程骨支架材料，可避免使用異體骨可能發(fā)生的交叉感染，有效解決臨床上自體骨與同種骨不足的問題，具有較好的應(yīng)用前景，但移植后發(fā)生的劇烈免疫排斥阻礙了異種骨移植的發(fā)展[2]。近年來，隨著對(duì)異種骨處理方法的不斷改進(jìn)，市場上出現(xiàn)多種能應(yīng)用于臨床的異種骨[3]，但仍缺乏對(duì)異種骨植入后介導(dǎo)的免疫毒性研究，其中的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚。

本研究以廣東冠昊生物科技股份有限公司采用已獲得專利授權(quán)(US6106555A，US6231614B1)制備的豬源性異種骨為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)肌肉植入實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)該重組異種骨對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫的影響，以評(píng)價(jià)其對(duì)機(jī)體的免疫安全性，從而為進(jìn)一步開展臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

Balb/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；L929細(xì)胞系購自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 試劑和儀器

刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)、植物血凝素(PHA)、弗氏完全佐劑(Freud’s)和MTT均購自Sigma公司；小牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品)；人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?；ELISA檢測(cè)試劑盒(表1)；流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)抗體(表2)。倒置顯微鏡(Olympus TH4-200)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，熱電儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson, USA)；多功能勻質(zhì)儀(Precellys 24，Bertin公司)。

表1 ELISA檢測(cè)試劑盒

Tab.1 ELISA Detection Kits

目錄號(hào)產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商6320MouseIgGELISAKitABI6380MouseIgMELISAKitABI6270MouseComplement3ELISAKitABI16193MouseIL-6ELISAKitABI21926MouseTNF-αELISAKitABI

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品及處理

重組異種骨由合作單位廣東冠昊生物科技股份有限公司提供，經(jīng)紫外輻照滅菌后，無菌分割成3 mm×3 mm×3 mm大小的骨粒，新鮮牛骨亦由此方法處理成相同大小的骨粒。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)ISO10993-12:2007[4]規(guī)定的原則制備樣品，取重組異種骨和新鮮牛骨經(jīng)多功能勻質(zhì)儀粉碎后精確稱重，以RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 mL/L FBS)為浸提介質(zhì)，充分吸脹后，按0.1 g/mL的含量在(37±1)℃的條件下浸提(24±2)h，50 g離心5 min，制備試驗(yàn)液，按ISO10993-5:2009[5]中要求，對(duì)重組異種骨和新鮮牛骨的試驗(yàn)液進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

表2 流式細(xì)胞術(shù)的相關(guān)抗體

Tab.2 Flow cytometry-related antibodies

目錄號(hào)產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商100204FITCanti-mouseCD3antibodyBioLegend400605FITCRatIgG2b,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend100708PEanti-mouseCD8antibodyBioLegend400507PERatIgG2a,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend104508PEanti-mouseCD69antibodyBioLegend400907PEArmenianHamsterIgGIsotypeCtrlAntibodyBioLegend103130PerCPanti-mouseCD45antibodyBioLegend100412APCanti-mouseCD4antibodyBioLegend400611APCRatIgG2b,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend115512APCanti-mouseCD19antibodyBioLegend400511APCRatIgG2a,κIsotypeCtrlAntibodyBioLegend

1.5 小鼠血清制備

小鼠摘眼球放血，收集血液，4 ℃靜置30 min，800 g離心15 min，收集上層血清，-20 ℃保存。

1.6 淋巴細(xì)胞制備

①人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)制備：抽取健康志愿者前臂靜脈血10 mL，加至淋巴分離液的上層，按照淋巴細(xì)胞分離液說明書，離心取淋巴細(xì)胞層加入10 mL無菌1×PBS，離心后收集人PBMC用含100 mL/L FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。②Balb/c小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)制備：小鼠摘眼球放血，收集血液至抗凝管；離心后棄上清，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心后收集鼠PBMC用1×PBS重懸細(xì)胞。③Balb/c小鼠淋巴結(jié)(lymph node)淋巴細(xì)胞制備：脫頸椎處死Balb/c小鼠，無菌摘取淋巴結(jié)，用1×PBS溶液200目篩網(wǎng)研磨過濾；離心后收集鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞用1×PBS重懸細(xì)胞。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組

體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)共分為3組：陰性對(duì)照組(空白培養(yǎng)基組)；重組異種骨組；新鮮牛骨組，體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)共分為4組：陰性對(duì)照組(空白培養(yǎng)基組)，重組異種骨組、新鮮牛骨組和陰性對(duì)照組(PHA)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)共分為4組：陰性對(duì)照組(假手術(shù)組)；重組異種骨組；新鮮牛骨組；BSA對(duì)照組(BSA和Freuds聯(lián)合免疫)

1.8 實(shí)驗(yàn)步驟

1.8.1 MTT實(shí)驗(yàn) 按照ISO10993-5:2009醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)MTT法進(jìn)行。

1.8.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 按照ISO10993-20:2006醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第20部分淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[6]。將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔100 μL，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。陽性對(duì)照組加入PHA至終濃度為10 ng/mL，實(shí)驗(yàn)平板在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后取出，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心后棄上清，加入DMSO，振蕩平板至甲臜顆粒完全溶解，在酶標(biāo)儀上于570 nm波長處測(cè)吸光度值(A)，參照波長為630 nm。各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的比值作為細(xì)胞的相對(duì)增殖比例。

1.8.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)血清中的免疫球蛋白(gG，IgM)、補(bǔ)體C3、TNF-α和IL-6水平。

1.8.4 流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子表達(dá) 收集淋巴細(xì)胞至離心管內(nèi)，500 g離心5 min，棄上清；用適量1×PBS懸起細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中(100 μL/管)，設(shè)空白對(duì)照組、同型對(duì)照組、單標(biāo)組和實(shí)驗(yàn)組，4 ℃，避光標(biāo)記30 min～1 h；在流式管內(nèi)加滿1×PBS，離心后棄上清，1×PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，利用Student’st或者ANOV方差檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組相比，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 異種骨浸提液對(duì)人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

按細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分別制備陰性對(duì)照組(空白培養(yǎng)基組)，重組異種骨組和新鮮牛骨組的試驗(yàn)液，取各組的試驗(yàn)液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，通過MTT摻入法檢測(cè)其細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，新鮮牛骨的試驗(yàn)液能抑制L929細(xì)胞增殖，而重組異種骨組未出現(xiàn)增殖抑制作用(圖1)。作為一種異源物質(zhì)，由于重組異種骨在臨床使用時(shí)可能會(huì)觸發(fā)針對(duì)該異源成分的免疫應(yīng)答，首先通過體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證是否存在免疫反應(yīng)。與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)相同的方法獲得各組試驗(yàn)液，取試驗(yàn)液與人PBMC共同孵育，結(jié)果如圖1所示，與陰性對(duì)照組相比，該異種骨不能引起人PBMC增殖反應(yīng)，新鮮牛骨卻對(duì)PBMC具有明顯的免疫抑制作用，其相對(duì)增殖比例明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該重組異種骨無明顯的淋巴細(xì)胞免疫刺激作用。

圖1 重組異種骨浸提液不會(huì)引起體外培養(yǎng)L929細(xì)胞毒性反應(yīng)和人PBMC增殖反應(yīng)

Fig.1 The extracts of heterogeneous bone did not cause either cytotoxicity of L929 cell nor proliferation of human PBMCsinvitro
與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.2 重組異種骨植入無明顯一般毒性影響

一般毒性研究為解釋免疫學(xué)反應(yīng)的發(fā)生提供了背景資料，包括一般臨床觀察和局部大體觀察。在本實(shí)驗(yàn)中，臨床觀察：整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期受試組動(dòng)物無一死亡。未發(fā)現(xiàn)明顯的毛發(fā)狀態(tài)、步態(tài)、體表孔口排液出現(xiàn)異常情況。局部大體觀察：重組異種骨植入的第1周內(nèi)，植入局部可見紅腫，之后紅腫情況逐漸消失，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期植入局部均無滲出。處死動(dòng)物時(shí)，可發(fā)現(xiàn)植入部位有囊腔形成，無可見的感染現(xiàn)象，囊腔周圍無小血管生成。新鮮牛骨組在植入部位可見明顯的紅腫，處死動(dòng)物時(shí)，植入部位無囊腔形成。在整個(gè)試驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)植入物丟失。

2.3 重組異種骨植入對(duì)小鼠血清補(bǔ)體C3濃度無影響

補(bǔ)體C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，本研究通過ELISA法動(dòng)態(tài)觀察不同植入時(shí)間血清中補(bǔ)體C3水平，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組(假手術(shù)組)相比，植入重組異種骨后的1、2、4周并不能引起補(bǔ)體C3的改變；而植入新鮮牛骨卻能夠?qū)е卵a(bǔ)體C3的升高(圖2，4周時(shí)與陰性對(duì)照組比較，P<0.05)。

圖2 重組異種骨不影響體內(nèi)血清補(bǔ)體C3水平

Fig.2 Heterogeneous bone did not affect serum C3invivo
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 異種骨植入對(duì)小鼠血清IgG、IgM濃度的影響

IgG、IgM是評(píng)價(jià)體液免疫功能的重要指標(biāo)。如圖3所示，與陰性對(duì)照組相比，隨著植入時(shí)間的增加，新鮮牛骨組和BSA對(duì)照組ELISA檢測(cè)的血清IgG、IgM均維持較高的水平(P<0.01)。而重組異種骨組的血清IgG、IgM僅在術(shù)后1周出現(xiàn)反應(yīng)性升高，第2和4周的抗體水平與陰性對(duì)照組相比都無明顯差異。這一結(jié)果顯示，該重組異種骨不會(huì)影響B(tài)alb/c小鼠免疫球蛋白分泌水平。

圖3 異種骨不影響體內(nèi)血清IgG、IgM水平

Fig.3 Heterogeneous bone did not affect the levels of serum IgG and IgMinvivo
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 重組異種骨植入小鼠后對(duì)植入物局部堿性磷酸酶(ALP)含量的影響

本實(shí)驗(yàn)通過免疫比濁法檢測(cè)了不同植入時(shí)間的小鼠植入部位的ALP水平，結(jié)果顯示，植入了重組異種骨并未引起植入的肌肉中ALP明顯改變；而新鮮牛骨和BSA對(duì)照組，同陰性對(duì)照組相比，卻均能導(dǎo)致局部ALP持續(xù)增加，至植入4周后ALP高達(dá)約300 U/L(圖4)。

圖4 異種骨不影響植入局部ALP水平

Fig.4 Heterogeneous bone did not affect the level of ALP at implantation site
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.6 重組異種骨植入對(duì)小鼠血清中炎性因子(TNF-α、IL-6)水平的影響

通過ELISA法分別檢測(cè)了小鼠血清中TNF-α和IL-6水平，發(fā)現(xiàn)同陰性對(duì)照組相比，除了植入重組異種骨1周后TNF-α出現(xiàn)短暫的升高(可能與手術(shù)引起的生理性炎癥反應(yīng)有關(guān)，P<0.05)，此重組異種骨不會(huì)引起TNF-α和IL-6明顯改變；而新鮮牛骨和BSA對(duì)照組卻導(dǎo)致了TNF-α和IL-6持續(xù)高表達(dá)(與陰性對(duì)照組比較，P<0.01)，提示炎癥的持續(xù)狀態(tài)(圖5)。此結(jié)果也與上述補(bǔ)體C3和ALP水平相一致。本研究所用異種骨材料不會(huì)導(dǎo)致小鼠的炎癥反應(yīng)。

2.7 重組異種骨植入對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分群和活化的影響

在不同處理時(shí)間(植入后第1、2、4周)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Balb/c小鼠PBMC中各類淋巴細(xì)胞亞群，結(jié)果如圖6所示，與陰性對(duì)照組相比，重組異種骨植入組CD3+PBMC、CD4+PBMC、CD8+PBMC的百分比無明顯差異。同時(shí)，分析這些淋巴細(xì)胞的活化發(fā)現(xiàn)，植入新鮮牛骨能上調(diào)PBMC中各T細(xì)胞亞群CD69表達(dá)(與陰性對(duì)照組比較，P<0.05)，促進(jìn)T細(xì)胞活化；而重組異種骨則不會(huì)影響T細(xì)胞活化(圖7)。繼而，通過CD19分子分析了Balb/c小鼠外周血中B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組異種骨不會(huì)影響B(tài)細(xì)胞的表達(dá)水平；而植入新鮮牛骨能顯著促進(jìn)B細(xì)胞(CD19+PBMC)百分比(圖8，與陰性對(duì)照組比較，P<0.05)。且B細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果也與上述血清中IgG、IgM含量相一致。通過檢測(cè)PBMC中T、B細(xì)胞的比例活化，說明該異種骨材料不能引起B(yǎng)alb/c小鼠的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。

圖5 重組異種骨不影響體內(nèi)血清TNF-α和IL-6水平

Fig.5 Heterogeneous bone did not affect the levels of serum TNF-α and IL-6invivo
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖6 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)PBMC分群Fig.6HeterogeneousbonedidnotaffecttheproportionofPBMCsfromBalb/cmiceinvivo與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖7 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)PBMC活化Fig.7HeterogeneousbonedidnotaffecttheactivationofPBMCsfromBalb/cmiceinvivo與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖8 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)外周血CD19+PBMC表達(dá)

Fig.8 Heterogeneous bone did not affect the expression of CD19+PBMCs from Balb/c miceinvivo
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.8 重組異種骨植入對(duì)小鼠淋巴結(jié)(LN)中淋巴細(xì)胞分群的影響

進(jìn)一步分析了植入部位引流淋巴結(jié)中相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表型，結(jié)果如圖9所示。植入重組異種骨4周后，淋巴結(jié)中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例與陰性對(duì)照組相比無明顯差異；但新鮮牛骨組和BSA對(duì)照組CD3+、CD4+T細(xì)胞的比例顯著低于陰性對(duì)照組。此外，植入重組異種骨不會(huì)影響淋巴結(jié)中B細(xì)胞的表達(dá)水平，而新鮮牛骨和BSA處理能促進(jìn)B細(xì)胞比例的持續(xù)增多(與陰性對(duì)照組比較，P<0.01)。

3 討 論

異種骨因有著與人骨相似的結(jié)構(gòu)，且其來源范圍廣，經(jīng)適當(dāng)處理可作為骨移植替代材料，故異種骨已越來越多的作為骨缺損替代物和椎間融合器等在臨床上使用，有效地避免了2次手術(shù)所帶來的創(chuàng)傷和感染風(fēng)險(xiǎn)。目前常采用的異種骨處理方法又深低溫冷凍、反復(fù)凍融、煅燒、交聯(lián)、脫蛋白、輻照或多種方法聯(lián)合運(yùn)用，不同的處理方法對(duì)其生物學(xué)特性存在不同的影響[7]，如目前已上市的異種骨Kiel骨、Bio-OSS等，抗原性低，非常疏松易碎，缺乏力學(xué)強(qiáng)度及骨誘導(dǎo)活性，僅作為骨缺損填充材料用于牙周外科發(fā)揮傳導(dǎo)成骨作用[3]。但實(shí)際應(yīng)用過程中，由于大量存在的異種骨主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)[2]、α-半乳糖基抗原(α-Gal抗原)[8-9]等抗原物質(zhì)，能夠活化T細(xì)胞和B細(xì)胞，引起細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，由此產(chǎn)生的抗體和細(xì)胞均能介導(dǎo)細(xì)胞毒作用并溶解靶細(xì)胞，最終導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)[10]。因此，異種骨的使用，必須在消除其免疫原性的前提下，使其具有與同種骨相似的效果，從而避免其免疫毒性作用而廣泛用于臨床治療。

圖9 重組異種骨不影響B(tài)alb/c小鼠體內(nèi)淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞分群

Fig.9 Heterogeneous bone did not affect the proportion of lymphocytes in lymph node from Balb/c miceinvivo
與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

廣東冠昊生物科技股份有限公司研發(fā)的重組異種骨，已在中國藥品生物制品檢定所完成產(chǎn)品的注冊(cè)檢驗(yàn)工作，試驗(yàn)已證實(shí)：該異種骨無免疫原排斥反應(yīng)，生物相容性較好，具有良好的生物安全性[10-13]，且不會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生長和功能等產(chǎn)生影響[14]。本研究通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，免疫毒性的功能性檢測(cè)如淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，非功能性檢測(cè)如Balb/c小鼠的血清補(bǔ)體C3、免疫球蛋白(IgG、IgM)含量，炎癥因子(TNF-α，IL-6)水平以及外周血PBMC分群(CD4+T細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、B細(xì)胞)活化等一系列體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)審視該異種骨植入介導(dǎo)的全身免疫毒性；此外，還憑借植入局部的肌肉ALP水平測(cè)定和植入部位臨近的引流淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞分群和活化的分析，進(jìn)一步明確該異種骨參與的局部免疫應(yīng)答。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組異種骨的試驗(yàn)液對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(L929)無細(xì)胞毒性，對(duì)人PBMC亦無免疫刺激作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與陰性對(duì)照組相比，新鮮牛骨組的血清中補(bǔ)體C3明顯升高(圖2)，這一結(jié)果也與圖3、圖5中血清免疫球蛋白(IgG、IgM)和炎癥因子(TNF-α、IL-6)水平升高相一致，說明植入新鮮牛骨可引起明顯的炎癥反應(yīng)；而重組異種骨植入未引起上述炎癥表現(xiàn)。免疫球蛋白和炎癥因子的含量與PBMC的比例和活化水平密不可分。如圖3、圖8所示，與陰性對(duì)照組相比，新鮮牛骨組的血清IgG、IgM與外周血B淋巴細(xì)胞含量一致，均在較高水平；圖5～7提示，新鮮牛骨組的血清TNF-α、IL-6與外周血T淋巴細(xì)胞的含量、活化水平密切相關(guān)，均較陰性對(duì)照組相比明顯升高；而重組異種骨組的血清IgG、IgM、TNF-α、IL-6，外周血T、B淋巴細(xì)胞的含量均與陰性對(duì)照組相比無明顯差異，表明該重組異種骨不能引起B(yǎng)alb/c小鼠的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。

植入局部免疫反應(yīng)的結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，新鮮牛骨組的肌肉局部ALP高表達(dá)，且ALP與成骨、炎癥和惡性腫瘤等密切相關(guān)[15]，而重組異種骨植入未能引起ALP的異常改變(圖4)；同時(shí)，新鮮牛骨組的淋巴結(jié)B淋巴細(xì)胞亦顯著增加，而重組異種骨組淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比均無明顯差異(圖9)，表明重組異種骨不會(huì)造成Balb/c 小鼠的局部免疫毒性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)該重組異種骨對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)不會(huì)造成毒性反應(yīng)，具有良好的免疫安全性，說明此重組異種骨有望成為一種理想的骨缺損修補(bǔ)材料。

然而，本研究還存在一些不足之處，比如，在天然免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞，其是否參與了重組異種骨介導(dǎo)的免疫毒性反應(yīng)；我們雖然發(fā)現(xiàn)重組異種骨植入不會(huì)引起血清補(bǔ)體C3的改變，但是否會(huì)影響其活化型C3a或C3b的水平；IgE，介導(dǎo)急性和超急性抑制排斥反應(yīng)的抗體，是否也參與了重組異種骨介導(dǎo)的免疫毒性反應(yīng)等一系列問題有待進(jìn)一步的試驗(yàn)來揭示。

綜上所述，本文從免疫學(xué)角度，從功能性和非功能性兩個(gè)方面檢測(cè)了重組異種骨介導(dǎo)的小鼠免疫毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組異種骨肌肉植入4周后，外周血中淋巴細(xì)胞分群活化，炎性因子、血清補(bǔ)體C3及IgG、IgM水平與對(duì)照組無明顯差異。此外，肉眼觀察植入部位無紅腫、可見囊腔形成，肌肉中ALP含量與對(duì)照組無明顯差異，且植入部位引流淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞分群也與對(duì)照組無明顯差異。由此說明，該重組異種骨不能引起小鼠免疫毒性反應(yīng)，從而為重組異種骨材料的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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(編輯 卓選鵬)

Effect of heterogeneous bone on the immune system of Balb/c mice

SUN Xiao-xia, GAI Xiao-xiao, SUN Li-kui, WANG Xian-mei, QIU Shi-dong, HOU Li

(Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices,State Food and Drug Administration; Key Laboratory of Biological Evaluation of Medical Devices of Shandong Province, Jinan 250101, China)

Objective To make a dynamic evaluation of the immunotoxicology caused by heterogeneous bone implantation and reveal its immunological mechanisms. Methods Heterogeneous bone was provided by Guangdong Grandhope Biotech Co., Ltd. Immunology of Balb/c mice by blood biochemical analysis, ELISA and flow cytometry after the test of lymphocyte transformationinvitro. We dynamically monitored the immunological changes Balb/c mice after 1 week, 2 weeks and 4 weeks of muscle implantation to evaluate the immunological effect of the heterogeneous bone on the body. Results Our experiments showed that the heterogeneous bone did not cause immune stimulation of lymphocytesinvitro, and there were no differences between implantation of heterogeneous bone and the sham operation in the levels of C3, IgG, IgM, inflammatory factors (TNF-α and IL-6) in serum and ALP in implantation site. Moreover, heterogeneous bone implantation did not affect the proportion or activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and lymphocytes in the lymph node. Conclusion The heterogeneous bone cannot mediate immunotoxicologyinvivo, which may provide experimental data and theoretical basis for clinical application of heterogeneous bone.

heterogeneous bone; immunotoxicology; Balb/c mouse

2014-10-31

2015-09-29

山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.ZR2014CQ041)；再生型醫(yī)用置入器械國家工程實(shí)驗(yàn)室PI項(xiàng)目(No.2012NELRMD007) Supported by the Youth Project of Natural Science Foundation of Shandong Province (No.ZR2014CQ041) and the State Engineering Laboratory PI Project of Renewable Medicinal Implantation Devices (No.2012NELRMD007)

孫曉霞. E-mail: sun2x@163.com

R318.08

A

10.7652/jdyxb201601004

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151216.1843.002.html(2015-12-16)