李 晶，羅妙莎，秦 斌，王 琰，董 蕾

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710004)

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阿托伐他汀對胰腺癌細胞PANC-1增殖、侵襲能力的影響及機制

李 晶，羅妙莎，秦 斌，王 琰，董 蕾

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710004)

目的 研究阿托伐他汀體外對胰腺癌細胞株PANC-1的影響及其機制。方法 不同濃度阿托伐他汀干預胰腺癌PANC-1細胞后，MTT法檢測細胞的增殖、黏附作用，Transwell小室測定胰腺癌細胞的侵襲能力；RT-PCR方法測定MMP-2和VEGF的mRNA表達變化；Western blot方法檢測ERK1/2的蛋白表達水平。結果 不同濃度阿托伐他汀干預胰腺癌PANC-1細胞后，細胞的增殖能力降低，并呈劑量時間依賴性。此外，阿托伐他汀可以抑制PANC-1細胞的黏附、侵襲能力，檢測加藥后PANC-1細胞內MMP-2、VEGF mRNA的相對表達量降低，與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 3，P=0.007)，ERK1/2蛋白的相對表達量降低(P=0.001 5)。結論 在體外細胞培養(yǎng)實驗中，阿托伐他汀能顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖、黏附、侵襲能力，其機制可能是通過調控MAPK/ERK1/2通路減少MMP-2及VEGF的表達而實現(xiàn)。

阿托伐他??；胰腺癌；侵襲

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤之一，它具有發(fā)病隱匿、病程短、進展快、病死率高的特點，預后極差。因此，新的治療研究方向對于胰腺癌的治療及預后顯得尤為重要。他汀類(statins)藥物是20世紀80年代后期開發(fā)的羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶作用而影響細胞內許多重要生物學功能如：細胞膜構成、糖蛋白合成、細胞內信號轉導、細胞周期進展等[1]。本研究通過MTT方法檢測阿托伐他汀在胰腺癌細胞增殖及黏附中的作用，采用Transwell小室檢測阿托伐他汀對胰腺癌細胞侵襲能力的影響，并采用Western blot和RT-RCR的方法探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌細胞PANC-1購于美國ATCC；阿托伐他汀(ATV，南京德寶生化器材有限公司)；吉西他濱(GEM，美國禮來公司)；DMEM(高糖型，美國Hyclone公司)；新生胎牛血清(杭州四季青生物技術公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；Metrigel(美國BD公司)；總RNA快速提取試劑盒(Fastgen200，西安沃爾森技術有限公司)；逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)；ERK1/2抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞PANC-1培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于含50 mL/L CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，細胞單層貼壁生長，至70%～80%融合時用胰蛋白酶消化傳代使用。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 收集處于對數(shù)生長期的PANC-1細胞，以每孔5×103個細胞接種到96孔板，細胞貼壁后，加入不同濃度(100、10、1、0.1 μmol/L) 的阿托伐他汀分別培養(yǎng)12、24、48 h，對照組不加藥，加入含等量DMSO的DMEM培養(yǎng)液。每個濃度設6個復孔，培養(yǎng)完畢后每孔加入MTT(5 mg/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL終止反應，以空白組調零，于波長490 nm處測定各孔吸光度值(A)，實驗重復3次。

1.2.3 細胞黏附實驗 本實驗采用無血清DMEM以1∶8稀釋Metrigel基質膠，100 μL/孔加入96孔板包被基底膜，4 ℃過夜，過夜后吸出培養(yǎng)板內多余液體，每孔加入50 μL無血清冷DMEM，室溫放置30 min，使基底膜水化。以不同濃度阿托伐他汀100、10、1、0 μmol/L，以及吉西他濱20 μmol/L干預PANC-1細胞24 h后，胰酶消化收集細胞，調整細胞濃度，以每孔5×103個細胞接種到水化基底膜后的96孔板，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h后取出，用PBS溶液沖洗兩遍，每孔加入MTT(5 mg/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，最后每孔加入DMSO 150 μL終止反應，以空白組調零，于波長490 nm處測定各孔吸光度值(A)，實驗重復3次。

1.2.4 細胞侵襲實驗 用100 μL稀釋至5 mg/mL的Matrigel基質膠鋪于24孔Transwell小室的上室中，重建基底膜。100、10、0 μmol/L阿托伐他汀及20 μmol/L吉西他濱干預PANC-1細胞24 h后收集，調整細胞密度為5×103/mL。Transwell小室上室每孔加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，用結晶紫染色，倒置顯微鏡觀察并計數(shù)。取5個視野(上、中、下、左、右)，照相，計數(shù)取平均值。

1.2.5 RT-PCR檢測MMP-2及VEGF基因的表達 阿托伐他汀10 μmol/L及吉西他濱20 μmol/L作用PANC-1細胞24 h后收集，試劑盒提取細胞的總RNA，按照操作說明應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以β-actin作為內參，Geneamp9600型PCR儀進行擴增，β-actin引物上游序列為5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游序列為5′-AGGAAG-GAAGGCTGGAAGAGTG-3′，目的產(chǎn)物長度為179 bp；VEGF引物上游序列為5′-CGGCGAAGAGAAGA-GACACATTG-3′，下游序列為5′-CGGGAAGGGAAGGGAAGGAC-3′，目的產(chǎn)物長度224 bp；MMP-2引物上游5′-TTGGTGGGAACTCAGAA-GG-3′，下游5′-CTTGCGGTCATCATCGTA-3′，目的產(chǎn)物長度140 bp。MMP-2與β-actin反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性60 s，退火54 ℃ 45 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；VEGF反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性60 s，退火60 ℃ 45 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，MMP-2和VEGF的基因表達水平以目的基因與內參β-actin吸光度的比值表示，并進行校正。

1.2.6 Western blot蛋白印跡分析 阿托伐他汀10 μmol/L及吉西他濱20 μmol/L干預PANC-1細胞24 h后收集，裂解細胞提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，分別取等量蛋白加上樣緩沖液于沸水中煮5 min，以100 mL/L SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電泳完畢后將凝膠上的蛋白經(jīng)濕轉轉膜儀以恒壓100 V轉至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris，1 mL/L Tween20，pH 7.4)封閉1～2 h，分別加入ERK1/2抗體及β-actin抗體，室溫孵育2～3 h或4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL化學發(fā)光系統(tǒng)顯色，以β-actin蛋白水平作為內對照，最后對結果利用Image J測量灰度值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 阿托伐他汀對胰腺癌PANC-1細胞的增殖能力具有抑制作用

我們首先觀察阿托伐他汀對人胰腺癌細胞PANC-1增殖能力的影響，以不同濃度阿托伐他汀作用于PANC-1細胞，在不同孵育時間點收集細胞，采用MTT法檢測阿托伐他汀對胰腺癌細胞增殖能力的影響(圖1)。阿托伐他汀誘導胰腺癌細胞死亡呈劑量和時間依賴性關系，在48 h時間點不同濃度之間進行t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 MTT法檢測ATV對胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響

Fig.1 The effect of ATV on the proliferation of PANC-1 cells determined by MTT assay

2.2 阿托伐他汀對胰腺癌細胞與基底膜的黏附能力的影響

腫瘤細胞與基底膜的黏附性與腫瘤的侵襲

及遠處轉移密切相關。本研究采用不同濃度阿托伐他汀干預后收集細胞，接種于含Matrigel的96孔板，MTT法檢測黏附于基底膜上細胞的吸光度(圖2)。與對照組相比，ATV干預組黏附于基底膜上的細胞減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ATV不同濃度組之間進行t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示阿托伐他汀可以抑制胰腺癌PANC-1細胞與基底膜的黏附能力，并呈劑量依賴性。

圖2 ATV對PANC-1細胞黏附能力的影響

Fig.2 The effect of ATV on the adhesion ability of PANC-1 cells
與對照組比較，*P<0.05，與對照組比較，**P<0.01。

2.3 阿托伐他汀可以抑制PANC-1細胞的侵襲能力

本實驗采用Matrigel重建基底膜的Transwell小室檢測PANC-1細胞的侵襲能力(圖3)。不同濃度阿托伐他汀干預后，細胞的侵襲能力降低，與對照組相比，ATV干預后PANC-1細胞水解Matrigel穿過基底膜的數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 3，0.000 3)，提示阿托伐他汀可以抑制PANC-1細胞水解細胞外基質，運動穿過基底膜至下室的能力，兩組不同濃度ATV干預結果之間進行t檢驗分析，隨劑量增加，侵襲抑制效應增強(P=0.043，圖4)。

圖3 穿過基底膜到達下室的細胞

Fig.3 The pictures of cells that crossed the basement membrane (×100)
A：對照組；B：ATV 10 μmol/L；C：ATV 100 μmol/L；D：GEM 20 μmol/L。

圖4 ATV干預可抑制PANC-1細胞的侵襲能力

Fig.4 The effect of ATV in inhibiting the invasion capability of PANC-1 cells
與陰性對照組比較，**P<0.01。

2.4 阿托伐他汀可以抑制PANC-1細胞MMP-2及VEGF mRNA的表達

通過前面的實驗可以看出，阿托伐他汀可以抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖、黏附、侵襲能力。本實驗進一步研究這些現(xiàn)象發(fā)生的分子機制，采用熒光定量PCR方法檢測ATV干預后細胞內MMP-2及VEGF mRNA的表達(圖5、圖6)：與對照組相比，ATV干預后，MMP-2及VEGF mRNA的表達均降低(P=0.001 3，0.007)，MMP-2與VEGF的表達與腫瘤細胞侵襲與轉移的發(fā)生密切相關，提示阿托伐他汀可能通過調控MMP-2及VEGF的表達而抑制胰腺癌PANC-1細胞的侵襲及轉移能力。

2.5 阿托伐他汀干預后PANC-1細胞內ERK1/2蛋白的表達降低

ERK1/2蛋白是MAPK信號通路的重要轉導因子之一，它的激活與細胞的增殖、分化密切相關。本實驗采用Western blot方法檢測ATV干預后胰腺癌PANC-1細胞ERK1/2蛋白的表達(圖7)。與對照組相比，阿托伐他汀干預后ERK1/2蛋白的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001 5)，提示阿托伐他汀可以抑制PANC-1細胞ERK1/2蛋白的表達，ATV可能具有抑制MAPK/ERK1/2通路的作用，這可能與本實驗中ATV干預后PANC-1細胞的黏附、侵襲能力降低有關。

圖5 RT-PCR檢測PANC-1細胞MMP-2及VEGF mRNA的表達

Fig.5 MMP-2 and VEGF mRNA expressions of PANC-1 cells detected by RT-PCR assay
A：MMP-2 mRNA的表達；B：VEGF mRNA的表達；C：內參β-actin；1：對照組；2：GEM 20 μmol/L；3：ATV 10 μmol/L。

圖6 胰腺癌PANC-1細胞MMP-2及VEGF mRNA相對表達的比較

Fig.6 Relative expressions of MMP-2 and VEGF mRNA of PANC-1 cells
A：MMP-2 mRNA相對表達量；B：VEGF mRNA相對表達量；與陰性對照組比較，**P<0.01。

圖7 胰腺癌PANC-1細胞ERK1/2蛋白相對表達量的比較

Fig.7 Comparison of the expression of ERK1/2 protein of PANC-1 cells
1：對照組；2：GEM 20 μmol/L；3：ATV 10 μmol/L；與陰性對照組比較，**P<0.01。

3 討 論

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，是目前病死率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤的復發(fā)轉移是導致臨床上胰腺癌患者死亡的主要原因。近來研究表明，他汀類作為羥甲基戊二酸單酰輔酶抑制劑，對很多腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導分化或凋亡、抑制血管生成的作用[2-3]。在胰腺癌動物實驗研究中，阿托伐他汀通過抑制Kras等蛋白的異戊烯化，抑制腫瘤的生長，增加存活率[4]。

本研究采用體外浸潤模型模擬腫瘤細胞對周圍相連組織的浸潤特性，實驗中鋪于Transwell上室的Matrigel基質膠，其中含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，可以模擬細胞外基質環(huán)境。細胞必須分泌水解酶，降解基質成分，通過變形運動才能穿過，這與體內侵襲遷移情況較為相似[5]，阿托伐他汀干預后，能夠水解細胞外基質并穿過基底膜的細胞數(shù)量減少，提示PANC-1細胞降解細胞外基質的侵襲能力明顯下降。此外，鋪有Matrigel的培養(yǎng)板可以檢測胰腺癌細胞與細胞外基質的黏附能力，結果也顯示阿托伐他汀可以降低PANC-1細胞與細胞外基質的黏附能力。本實驗模擬腫瘤細胞轉移過程中的增殖、黏附及侵襲步驟，提示阿托伐他汀有可能控制胰腺癌腫瘤細胞的生長并減少侵襲及轉移的發(fā)生。

腫瘤細胞侵襲、轉移的發(fā)生包含多種分子機制，過程非常復雜，其中組織基質金屬蛋白酶(MMPs)可以通過蛋白分解途徑水解細胞外基質及非蛋白分解途徑參與腫瘤的侵襲及轉移[6]，MMP-2是MMPs家族中的重要成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在臨床胰腺癌標本中的表達率可達到93%，而它幾乎不表達于正常組織，胰腺癌組織中MMP-2的陽性表達率與淋巴結轉移和向周圍組織器官浸潤有關[7]，可見MMP-2對胰腺癌的發(fā)展具有重大影響，并與預后密切相關[8]。因此，MMPs的表達與腫瘤細胞侵襲、轉移的發(fā)生密切相關。VEGF是目前所知主要的血管內皮生長因子，在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)VEGF表達與腫瘤微血管密度有關，VEGF高表達以及腫瘤新生血管豐富的患者預后不良[9]。本研究在mRNA水平上研究阿托伐他汀干預PANC-1細胞后細胞內MMP-2及VEGF的變化，發(fā)現(xiàn)MMP-2與VEGF mRNA的表達降低，這恰好解釋了阿托伐他汀的侵襲抑制作用，而對于VEGF表達的抑制，我們推測其可能抑制腫瘤的血管生成能力。

MAPK信號轉導通路存在于大多數(shù)細胞內，被認為是許多信號通路的共同通路[10]。ERK1/2是MAPK信號通路的重要信號轉導因子之一。有研究表明，抑制MAPK/ERK1/2細胞信號通路能夠下調VEGF表達，進而抑制腫瘤新生血管的生成及浸潤轉移能力[11]。在體外動物實驗中阿托伐他汀可以通過抑制ERK1/2的表達，抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生長[12]，而MMPs的表達也受到多種細胞因子及生長因子的調節(jié)，這些因子常?？梢酝ㄟ^激活細胞內的MAPK信號通路來發(fā)揮作用[13]。本實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀干預后，PANC-1細胞內ERK1/2蛋白的表達降低，提示阿托伐他汀可以通過調控MAPK/ERK1/2通路抑制胰腺癌細胞PANC-1的生長、黏附、侵襲能力。有研究表明，ERK可通過活化核轉錄因子AP-1[14]或Ets[15]調節(jié)MMP-9的表達，并通過刺激核轉錄因子AP-2蛋白的表達[16]或活化核轉錄因子Sp1[17]調節(jié)MMP-2的表達。因此，推測阿托伐他汀可能通過抑制MAPK/ERK1/2通路而減少MMPs及VEGF的表達。由于體外細胞實驗本身的局限性，也不排除其他信號傳導通路的參與，其他可能參與的信號傳導通路以及這些通路間是否相互影響仍有待探討。

總之，本實驗結果表明阿托伐他汀可以抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖、黏附、侵襲能力，其可能的機制是通過抑制MAPK/ERK1/2通路下調MMP-2及VEGF的表達，但具體機制尚需要進一步研究。胰腺癌的侵襲轉移與預后密切相關，阿托伐他汀有可能成為抑制胰腺癌細胞侵襲、轉移的發(fā)生，改善預后的治療方案之一。

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(編輯 韓維棟)

Effects of atorvastatin on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cell PANC-1 and its mechanism study

LI Jing, LUO Miao-sha, QIN Bin, WANG Yan, DONG Lei

(Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To investigate the effects of atorvastatin on the invasion and proliferation abilities of pancreatic cancer cell PANC-1. Methods PANC-1 cells were exposed to different concentrations of atorvastatin. We used MTT assay to detect the proliferation and adhesion capabilities of PANC-1 cells. Transwell chamber was used to detect the invasion ability of PANC-1 cells. The expressions of MMP-2 and VEGF mRNA were assayed by RT-PCR while the expression of ERK1/2 protein was assayed by Western blot. Results Different concentrations of atorvastatin could inhibit the proliferation, adhesion and invasion abilities of PANC-1 cells in a dose-dependent manner. Atorvastatin of 10 μmol/L inhibited the expressions of MMP-2 (P=0.001 3), VEGF mRNA (P=0.007) and ERK1/2 protein (P=0.001 5) significantly. Conclusion Atorvastatin significantly inhibits the proliferation, adhesion and invasion capabilities of PANC-1 cellsinvitro. The mechanism may be related to inhibiting MAPK/ERK1/2 pathway and suppressing the expressions of MMP-2 and VEGF.

atorvastatin; pancreatic cancer; invasion

2015-05-27

2015-09-30

“十二五”農村領域國家科技計劃課題(No.2012BAJ18B00) The planning subject ofthe Twelfth Five-year Planin National Science and Technology for Rural Development in China (No.2012BAJ18B00)

董蕾. E-mail: dong556@126.com

R737.33

A

10.7652/jdyxb201601006

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1647.018.html(2015-12-09)