劉學(xué)良，周 沖，徐 斌，鄭曉梅，劉 亮

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1. 神經(jīng)外科；2. 神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000)

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相關(guān)蛋白在攜帶載脂蛋白-J基因大鼠BMSCs中的表達(dá)及意義

劉學(xué)良1，周 沖1，徐 斌1，鄭曉梅2，劉 亮1

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1. 神經(jīng)外科；2. 神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的 檢測重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ在不同量、不同時(shí)間條件下轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，并測定載脂蛋白-J(ApoJ)在靶細(xì)胞中能否高表達(dá)。方法 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，并用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000分別介導(dǎo)0.8、1.2、1.6、2.0 μg重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染，置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，測定在24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。蛋白免疫印跡法分別檢測pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照組ApoJ的表達(dá)情況。結(jié)果 不同的質(zhì)粒量中1.6 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒與3.0 μL脂質(zhì)體制備的復(fù)合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，分別作用24、48、72 h可達(dá)27.8%、34.3%、28.2%。蛋白免疫印跡法檢測到pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組大量ApoJ表達(dá)，空質(zhì)粒及空白對照組見微量ApoJ表達(dá)；并且pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組Apo-J的表達(dá)明顯高于空載體及空白對照組(P<0.05)。結(jié)論 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)可將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ成功轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，ApoJ在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中得到大量表達(dá)。

載脂蛋白-J；重組質(zhì)粒；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；蛋白免疫印跡法

載脂蛋白J(ApoJ或稱clusterin, CLU)是從人血漿HDL中新分離出的一種酸性糖蛋白，分子量70 ku，由α及β亞基通過二硫鍵相連而成,廣泛分布于人體各種組織,腦組織內(nèi)主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。ApoJ除了負(fù)責(zé)運(yùn)輸脂質(zhì)外，還參與精子成熟、膜再循環(huán)及神經(jīng)元的保護(hù)等生理過程[1]。在損傷組織中，ApoJ基因表達(dá)升高，參與組織損傷的修復(fù)，可抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，調(diào)控細(xì)胞的死亡和細(xì)胞膜的更新。相關(guān)研究顯示ApoJ在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有高表達(dá)[2]。腦出血后ApoJ可能隨著一系列病理損傷的進(jìn)展，在腦出血病灶周圍表達(dá)增加，以此來保護(hù)瀕臨凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)，并檢測ApoJ在靶細(xì)胞中能否高表達(dá)，為進(jìn)一步研究高表達(dá)ApoJ基因的BMSCs移植治療腦出血疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和大鼠BMSCs

重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ和空質(zhì)粒pEGFP-N1由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司提供；大鼠BMSCs由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心贈送。

1.2 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibson公司)；脂質(zhì)體LipofectaminTM2000(Nitrogen公司)：高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液，配有一支PMDF(solaria)；兔抗鼠ApoJ抗體-Clustering Antibody(Proteintech公司)；Anti-GAPDH(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二抗-羊抗兔IgG(bios)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(solaria)；4*SDS-PAGE loading buffer(bidder)；10～170 ku電泳蛋白彩色預(yù)染Marker(thermo)；ECL發(fā)光液(Millipore)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng) 從液氮中迅速取出BMSCs凍存管，于37 ℃水浴振蕩使細(xì)胞在30～60 s內(nèi)完全融化；用750 mL/L乙醇擦洗凍存管后，置于超凈臺中將BMSCs懸液移入離心管，加入10倍體積的α-MEM培養(yǎng)基，室溫800 r/min離心5 min；去除上清液，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法[3]培養(yǎng)-完全培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基加100 mL/L的胎牛血清、100 U/mol雙抗)輕輕重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶；37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)。待BMSCs生長至70%～80%匯合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化大約2 min，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，將BMSCs從瓶壁上輕輕吹打下來，收集細(xì)胞，離心后加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)不同DNA濃度的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 用胰蛋白酶將BMSCs從培養(yǎng)瓶上消化下來，以4～5×106接種于6孔板中，細(xì)胞融合達(dá)90%以上時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d換液。轉(zhuǎn)染前將6孔板中的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2遍，加入2 mL無血清培養(yǎng)基。取滅菌的1.5 mL Eppendorf管，EP管中用α-MEM培養(yǎng)基分別稀釋0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒至200 μL(全部標(biāo)為①)，溫和混勻。另取相同數(shù)量的EP管，用α-MEM培養(yǎng)基分別稀釋3.0 μL LipofectaminTM2000至200 μL(全部標(biāo)為②)，室溫孵育5 min。將①號管中培養(yǎng)基分別與②號管中培養(yǎng)基混合，使總體積為400 μL，溫和混合，復(fù)合物于室溫孵育20 min。轉(zhuǎn)染分為A1組、A2組、A3組、A4組(每組3孔)，分別將含0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒的400 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到相對應(yīng)的孔中轉(zhuǎn)染(并在6孔板上做好標(biāo)記)；轉(zhuǎn)染后在37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 h，其后更換含有血清無雙抗的全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于24、48、72 h后熒光顯微鏡下觀察其熒光表達(dá)情況，并測定轉(zhuǎn)染后1、2、3 d的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 轉(zhuǎn)染效率的測定 分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，在10個(gè)均勻分布的視野下用100倍鏡觀察，10個(gè)視野轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)之和/細(xì)胞總數(shù)之和=該孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 同1.3.2的方法準(zhǔn)備好待轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs。轉(zhuǎn)染分為A、B、C三組(每組各2孔)：A組為實(shí)驗(yàn)組, 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ(加入DNA的濃度與1.3.2中轉(zhuǎn)染效率最高組相同)；B組為對照組, 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1(所用空質(zhì)粒pEGFP-N1 的量與A組所用質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ的量相同)；C組為空白對照組, 加入等量質(zhì)脂體。其它步驟與1.3.2中均相同。在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.3.5 單層貼壁細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取及Western blot檢測ApoJ的表達(dá) 據(jù)1.3.4知：待提取蛋白的貼壁細(xì)胞分為A組(pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為實(shí)驗(yàn)組)、B組(用空pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為對照組)、C組(空白對照組)。在轉(zhuǎn)染72 h后，以細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，裂解完后，用干凈的刮棒快速的將細(xì)胞刮于孔壁的一側(cè)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行)。然后于4 ℃下12 000 r/min離心5 min(提前開離心機(jī)預(yù)冷)。將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 mL的離心管中做好相應(yīng)標(biāo)記，每管按照上清液：loading buffer=1∶3的體積比加入4*SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min。應(yīng)用Western blot對ApoJ表達(dá)進(jìn)行檢測：制膠，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加1∶1 000兔抗鼠ApoJ抗體4 ℃孵育過夜，加羊抗兔IgG二抗(1∶1 500)室溫孵育2 h，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。內(nèi)參為Gapdh。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算機(jī)軟件分析灰度值。

1.4 主要觀察指標(biāo)

①大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察；②脂質(zhì)體介導(dǎo)下pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs的效率；③Western blot檢測重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ape組、空pEGFP-N1質(zhì)粒組及空白對照組中ApoJ表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察，大鼠BMSCs未貼壁時(shí)為圓形單核細(xì)胞，折光性強(qiáng)；貼壁后形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)槎嘟切魏捅馄叫?；?xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)4～6 d可達(dá)90%融合，形態(tài)變?yōu)殚L梭形為主(圖1A)。第3～4代后細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定相同，擠壓成束狀、漩渦狀，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，核大，核仁也較明顯(圖1B)。

圖1 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

Fig.1 Morphological observation of rats BMSCs (×50)
A：4～6 d的BMSCs；B：3～4代的BMSCs。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后綠色熒光觀察

分別在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，可以看到各組細(xì)胞均有綠色熒光出現(xiàn)，但各組表達(dá)綠色熒光融合蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)量存在明顯差異。0.8、1.2、1.6 μg pGFP-N1-apoJ質(zhì)粒分別與3.0 μL LipofectaminTM2000脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染后，陽性細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多，且1.6 μg pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果最高。然而，當(dāng)質(zhì)粒的量增加到2.0 μg時(shí)，綠色熒光融合蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)量并沒有提高，反而降低(圖2)。

圖2 EGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，綠色熒光融合蛋白在BMSCs中的表達(dá)

Fig.2 The expression of green fluorescent fusion protein in BMSCs after transfection of EGFP-N1-apoJ plasmid (×100)
A1、A2、A3、A4，分別是0.8、1.2、1.6、2.0 μg。A～F、M～R熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞；G～L、S～X可見光下觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞；(A、G，D、J,M、S，P、V)、(B、H，E、K，N、T，Q、W)、(C、I，F(xiàn)、L，O、U，R、X)分別是轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后的觀察結(jié)果。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率的測定結(jié)果

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用重復(fù)方差分析。結(jié)果顯示，不同質(zhì)粒濃度情況下轉(zhuǎn)染效率有差異(P=0.001)，不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染效率無明顯差異(P=0.993)，轉(zhuǎn)染效率隨著質(zhì)粒濃度變化有變化趨勢(P=0.041，表1)。采用3.0 μL LipofectaminTM2000脂質(zhì)體與不同質(zhì)量的質(zhì)粒配制成復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨著質(zhì)粒濃度的提高，轉(zhuǎn)染效率增加；質(zhì)粒的量達(dá)到1.6 μg時(shí)，在3個(gè)時(shí)間段獲得最高的轉(zhuǎn)染效率分別為27.8%、34.3%、28.2%，提高質(zhì)粒DNA至2.0 μg卻并沒有提高轉(zhuǎn)染效率(圖3)。提示1.6 μg pEGFP-N1-apo質(zhì)粒與3.0 μL脂質(zhì)體配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物為轉(zhuǎn)染的最適條件，可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

表1 4種不同處理方式在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染效率的方差分析

Tab.1 Analysis of transfection efficiency by 4 different treatments at different time points

變異來源SSνMSFP處理0.07130.02446.4740.001個(gè)體時(shí)間誤差0.00480.001時(shí)間0.00320.0023.9240.041時(shí)間X處理0.00164.500E-50.1130.993個(gè)體內(nèi)誤差0.006160.001

圖3 不同pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒量、不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率

Fig.3 The transfection efficiency of pEGFP-N1-apoJ plasmid at different concentrations and time points

2.4 Western blot檢測ApoJ的表達(dá)情況

使用Western blot法對轉(zhuǎn)染72 h后的BMSCs表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒組在相對分子質(zhì)量70 ku處可見大量ApoJ蛋白表達(dá)，空質(zhì)粒及空白對照組見微量ApoJ蛋白表達(dá)(圖4A)。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，ApoJ的表達(dá)明顯高于空載體組和空白對照組(P<0.05，圖4B)。

3 討 論

BMSCs最早由PITTENGER等[4]于1999年從骨髓中分離培養(yǎng)出來，它具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[5]，骨髓組織中含量最為豐富，在適宜的微環(huán)境里具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化的能力[6-9]。鑒于BMSCs具有自我復(fù)制和多向分化潛能[10]，且易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、能在宿主體內(nèi)長期存活、易于外源基因轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，其在細(xì)胞治療和基因治療方面有良好的應(yīng)用前景[11-12]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用中，BRASELTON[13]和MOSEY[14]兩個(gè)研究小組分別采用不同的方法證實(shí)，體外擴(kuò)增的BMSCs可通過血腦屏障經(jīng)尾靜脈注射、骨髓移植、腦部直接注射等途徑進(jìn)入腦內(nèi)，廣泛分布于全腦。這一研究為BMSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 轉(zhuǎn)染72 h后各組ApoJ蛋白的表達(dá)情況

Fig.4 The expression of ApoJ protein in each group after transfection of 72 h
A：Western blot檢測；B：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1：pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；2：空pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3：空白對照組。

本實(shí)驗(yàn)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-apoJ質(zhì)粒對大鼠BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，探索并優(yōu)化轉(zhuǎn)染相關(guān)條件[15-16]。在合適的質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例下[17]，脂質(zhì)體可高效的介導(dǎo)外源性質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染BMSCs。本實(shí)驗(yàn)建立ApoJ基因修飾的BMSCs體系，經(jīng)熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)及Western檢測，證實(shí)ApoJ在BMSCs中得以轉(zhuǎn)錄和翻譯，說明攜帶外源性ApoJ基因的BMSCs構(gòu)建成功。

基于上述原因，采用表達(dá)外源性ApoJ的BMSCs移植治療腦出血，可以產(chǎn)生雙重作用：首先，攜ApoJ基因BMSCs可大量表達(dá)ApoJ，ApoJ可促進(jìn)受損神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能恢復(fù)，并抑制炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。再者，BMSCs能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以補(bǔ)充腦出血后腦損傷丟失的細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)上修復(fù)和重建神經(jīng)環(huán)路。本研究為進(jìn)一步開展攜ApoJ基因BMSCs移植治療腦出血的實(shí)驗(yàn)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為后續(xù)進(jìn)一步研究ApoJ的作用機(jī)制及為臨床基因工程干細(xì)胞移植治療腦出血提供一定的基礎(chǔ)。

[1] WICHER G, FEX SVENNINGSEN A, VELSECCHI I, et al. Extracellular c luster inpromotes neuronal network complexityinvitro[J]. Neuroreport, 2008, 19(15):1487-1491.

[2] ELLIOTT DA, WEICKERT CS, GARNER B. Apolipoproteins in the brain: implications for neurological and psychiatric disorder[J]. Clin Lipidol, 2010, 51(4):555-573.

[3] 袁斌，馬櫻，閆銘，等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的改良培養(yǎng)方法及Hoechst體外標(biāo)記研究[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2011, 27(1):61-63

[4] ANJOS-AFONSO F, SIAPATI EK, BONNET D.Invivocontribute of murine mesenchymal stem cells into multiple cell types under minimal damage conditions[J]. Cell Sci, 2004, 117(23):5655-5664.

[5] BIANCO P, ROBEY PG, SIMMONS PJ. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting history, concepts, and assays[J]. Cell Stem Cell, 2008, 2(4):313-319.

[6] PINEY DG. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy[J]. Cell Cycle, 2007, 6(23):2884-2889.

[7] RIDDEN M, DICKER A, GOTHERSTROM C, et al. Functional characterization of human mesenchymal stem cell derived adiposities[J]. Brioche Biopsy’s Res Common. 2003, 311(2):391-397.

[8] YAN H, YU C. Repair of full-thickness cartilage defects with cells of different origin in a rabbit model[J]. Arthroscopy, 2007, 23(2):178-187.

[9] MUNOZ JR, STAUDINGER BR, ROBINSON AP, et al. Human stem/progenitor cells from bone marrow promotes neurogenesis of endogenous neural stem cells in the hippocampus of mice[J]. Proc Natal Accad Sic US A, 2005, 102(50):18171-18176.

[10] MIGUEL JJ, ERIC’S A, CONGEST P. Mesenchymal stem cells[J]. Exp Boil Med (Maywood), 2001, 226(6):507-520.

[11] DAWN B, BOLLIX R. Adult bone marrow-derived cells: regenerative potential, plasticity, and tissue commitment[J]. Basic Res Cardio, 2005, 100(6):494-503.

[12] MCFARLANE K, AGO X, LIU YB, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stoma cells accelerate wound healing in the rat[J]. Wound Repair Regen, 2006, 14(4):471-478.

[13] BRASELTON TR, ROSIS FMV, KISMET GI, et al. From marrow to brain: expression of neuronal phenol types in adult mice[J]. Science, 2000, 290(5497):1775-1779.

[14] MESSAY E, CHANDRASIS KJ, HARTE G, et al. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vive from bone marrow[J]. Science, 2000, 290(5497): 1779-1782.

[15] WILLIAMS DJ, PUHL HL, IKEDA SR. A simple, highly efficient method for heterologous expression in mammalian primary neurons using cationic lipid-mediated mRNA transfection[J]. Front Neurosci, 2010, 4:181.

[16] OBATA Y, CIOFANI G, RAFFA V, et al. Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J]. Nanomedicine, 2010, 6:70-77.

[17] ZHANG S, ZHI D, HUANG L. Lipid-based vectors for siRNA delivery[J]. J Drug Target, 2012, 20(9):724-735.

(編輯 卓選鵬)

The expression of associated proteins in rat BMSCs with ApoJ gene

LIU Xue-liang1, ZHOU Chong1, XU Bin1, ZHENG Xiao-mei2, LIU Liang1

(1. Department of Neurosurgery; 2. Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

Objective To detect the transfection efficiency of recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ in rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) at different DNA concentrations and time points and to detect the expression of apoJ in target cells. Methods We used bone marrow adherent culture method to culture rat BMSCs. LipofectaminTM2000 mediated respectively 0.8, 1.2, 1.6 and 2 μg of pEGFP-N1-apoJ recombinant plasmid to transfect BMSCs. The transfection results were observed under the fluorescence microscope. We determined the transient transfection efficiency at 24 h, 48 h and 72 h. Western blot was used to detect the expression of ApoJ in pEGFP-N1-apoJ plasmid transfection group, empty pEGFP-N1 plasmid transfection group and control group. Results In different DNA concentrations, when 1.6 μg of pEGFP-N1-apoJ plasmid was transfected with 3.0 μL of liposome in rat BMSCs, the transient transfection efficiency was the highest; it reached 27.8%, 34.3% and 28.2% at 24 h, 48 h and 72 h. Western blot results showed that pEGFP-N1-apoJ recombinant plasmid expressed large amounts of ApoJ; small amounts of protein expression of ApoJ was found in the empty plasmid and the control groups. The expression of ApoJ was higher in PEGFP-N1-apoJ group than in the empty carrier and the control groups (P<0.05). Conclusion Recombinant plasmid PEGFP-N1-apoJ can be transfected into rat BMSCs successfully via liposome. ApoJ is expressed in large amounts in rat BMSCs.

apolipoprotein-J; recombinant plasmid; bone marrow mesenchymal stem cell; transient transfection; Western blot

2015-04-23

2015-11-04

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目課題(No.12ZA075)；瀘州市科技局課題(No.2011-I-S45) Supported by Key Projects of Sichuan Provincial Education Department (No.12ZA075) and Luzhou Science and Technology Bureau (No.2011-I-S45)

劉亮. E-mail: liust@163.com

Q782

A

10.7652/jdyxb201601012

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151210.1744.008.html(2015-12-10)