路晨陽(yáng)，白改改，申秋菊，蒙 珊，惠凌云，蘇 丹，張王剛，周芙玲

(西安交通大學(xué)：1. 第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710061)

?

抗氧化劑對(duì)過(guò)氧化氫處理的急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖的影響

路晨陽(yáng)1，白改改1，申秋菊1，蒙 珊1，惠凌云2，蘇 丹1，張王剛1，周芙玲1

(西安交通大學(xué)：1. 第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710061)

目的 通過(guò)建立急性單核細(xì)胞白血病活性氧(ROS)細(xì)胞模型，觀察抗氧化劑對(duì)其增殖的影響。方法 選用人單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株，用不同濃度過(guò)氧化氫(H2O2)處理，成功建立ROS細(xì)胞模型后給予不同濃度抗氧化劑超氧化物歧化酶(SOD)處理，檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)ROS含量、線粒體膜電位的變化。結(jié)果 低濃度H2O2(50 μmol/L)刺激U937細(xì)胞增殖；高濃度H2O2(500 μmol/L)對(duì)U937細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。以50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞48 h建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｕ937細(xì)胞內(nèi)存在少量ROS，少量凋亡細(xì)胞；50 μmol/L H2O2處理后細(xì)胞內(nèi)ROS增多，線粒體膜電位升高，凋亡率下降，細(xì)胞增殖旺盛，新合成的DNA增多；加入不同濃度抗氧化劑SOD，隨著SOD濃度升高，ROS含量減少，線粒體膜電位下降，凋亡率增加，細(xì)胞增殖減慢，新合成的DNA減少，表現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)論 抗氧化劑對(duì)急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖有抑制作用，且表現(xiàn)劑量依賴性。

急性單核細(xì)胞白血??；活性氧自由基(ROS)；抗氧化劑；細(xì)胞增殖；線粒體膜電位；超氧化物歧化酶(SOD)

活性氧(reactive oxide species, ROS)是指一類化學(xué)活性分子家族，其包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子O2-·)、單線態(tài)氧(O2)及過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等，參與調(diào)控生物細(xì)胞功能、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中可見(jiàn)內(nèi)源性ROS水平升高[4]。ROS水平的升高與許多腫瘤細(xì)胞發(fā)展相關(guān)，可促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)化，上調(diào)存活途徑和DNA損傷誘導(dǎo)的突變。ROS還可調(diào)節(jié)磷酸激酶、磷酸酶、氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)惡變。研究組前期及SALLMYR等[5-9]的研究發(fā)現(xiàn)ROS參與急性白血病的發(fā)生發(fā)展。本研究選用人急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株，通過(guò)模擬急性單核細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)時(shí)的高增殖狀態(tài)，研究抗氧化劑對(duì)其增殖的作用，從而為防治白血病復(fù)發(fā)的抗氧化劑藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

二甲基亞砜( dimethyl sulphoxide, DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]、超氧化物歧化酶(SOD)、H2O2均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；EdU DNA細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自銳博生物科技有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；JC-1(線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

用含100 mL/L胎牛血清、雙抗(青、鏈霉素各100 U/100 mL)的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、50 mL/L CO2條件下生長(zhǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 不同濃度HO對(duì)U937細(xì)胞的影響

1.3.1 MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，調(diào)至密度為5×105/mL，接種于96孔板培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0、25、50、100、150、200、500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000 μmol/L的H2O2作為實(shí)驗(yàn)組，不加藥物組為陰性對(duì)照，不加細(xì)胞的1640培養(yǎng)液為空白組，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，加DMSO每孔150 μL，震蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A值(λ=490 nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制U937細(xì)胞生存曲線。細(xì)胞存活率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。并用倒置顯微鏡觀察U937細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 H2O2對(duì)U937細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 嚴(yán)格按照ROS檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品手冊(cè)，檢測(cè)濃度為50、500 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞0～72 h細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.3.3 透射電鏡觀察H2O2作用U937細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 濃度為50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞48 h，用25 mL/L戊二醛固定液4 ℃固定細(xì)胞，0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗，10 g/L四氧化鋨固定液固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2 μm，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位，超薄切片機(jī)制作50～70 nm超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

則主塔樁基滿足鄰樁人工開(kāi)挖要求，但為了避免施工相互影響，采取間隔交錯(cuò)施工，群樁開(kāi)挖及澆筑順序?yàn)椋?#、8#、15#、4#、11#、18#→3#、13#、6#、16#→2#、14#、5#、17#→7#、9#、10#、12#。

1.4 不同濃度抗氧化劑對(duì)HO作用U937細(xì)胞后的影響

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立低濃度H2O2刺激細(xì)胞增殖模型(50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞48 h)為模型組(即H2O2組)；將H2O2組細(xì)胞密度調(diào)至2×105/mL，每孔1.0 mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入不同濃度抗氧化劑SOD(20、100、300 U/L)處理48 h為實(shí)驗(yàn)組。并設(shè)正常U937細(xì)胞為對(duì)照組。

1.4.2 細(xì)胞內(nèi)ROS的變化 嚴(yán)格按照活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.4.3 線粒體膜電位的影響 分別于H2O2處理前后、不同濃度抗氧化劑處理前后，用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1檢測(cè)各組U937細(xì)胞線粒體膜電位變化；并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡情況。

1.4.4 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖變化 分別于H2O2處理前后、不同濃度抗氧化劑處理前后，嚴(yán)格按照EdU DNA細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度HO對(duì)U937細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，H2O2對(duì)U937細(xì)胞同一處理時(shí)間時(shí)，呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的雙向調(diào)節(jié)作用。同一H2O2濃度作用時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降。50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞48 h細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、穩(wěn)定(圖1)。

2.2 倒置顯微鏡觀察不同濃度HO作用后U937細(xì)胞的形態(tài)變化

低濃度H2O2(50 μmol/L)作用U937細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活躍，數(shù)量增多，體積變大，外形規(guī)則，邊緣光滑，折光性好，死亡細(xì)胞很少，活細(xì)胞數(shù)明顯較正常U937細(xì)胞組多，隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞增殖逐漸減慢，數(shù)量減少，細(xì)胞變形并出現(xiàn)細(xì)胞碎片(圖2)。

2.3 不同濃度HO作用U937細(xì)胞內(nèi)活性氧變化

不同濃度H2O2處理U937細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加；50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后，1 h時(shí)ROS含量迅速增加，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS緩慢增加；而500 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞，2 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量迅速增加，后隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量緩慢增加，比50 μmol/L H2O2產(chǎn)生的ROS含量高(圖3)。

圖1 不同時(shí)間及不同濃度H2O2對(duì)U937細(xì)胞存活率的影響

Fig.1 Effects of different time and concentration of H2O2on U937 cell survival rate

圖2 不同濃度H2O2作用U937細(xì)胞后的形態(tài)變化

Fig.2 Morphological changes of U937 cells treated with different concentrations of H2O2(×40)
A：正常U937細(xì)胞；B：50 μmol/L H2O2；C：200 μmol/L H2O2；D：500 μmol/L H2O2。

圖3 不同濃度H2O2處理U937細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)DCF熒光強(qiáng)度

Fig.3 DCF fluorescence intensity of U937 cells treated with different concentrations of H2O2

2.4 透射電鏡觀察不同濃度HO作用U937細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

正常U937細(xì)胞呈圓形，外觀規(guī)則，細(xì)胞表面突起，核質(zhì)比例高，核染色質(zhì)豐富、分布均勻。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多細(xì)胞器，線粒體形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整。50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量多，大小均勻，呈圓形，線粒體腫脹，嵴排列紊亂，部分可見(jiàn)嵴溶解，染色質(zhì)輕度凝集(圖4)。

2.5 熒光顯微鏡觀察不同濃度抗氧化劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS活性的影響

細(xì)胞內(nèi)ROS特異性熒光探針DCF發(fā)綠色熒光。正常U937細(xì)胞內(nèi)存在少量ROS，綠色熒光較弱(圖5A)；50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量增多，綠色熒光增強(qiáng)且明顯高于正常U937細(xì)胞(圖5B)。50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞48 h后再加入不同濃度抗氧化劑，隨抗氧化劑濃度的升高，綠色熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)出劑量依賴性(圖5的C～E)。

圖4 U937細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

Fig.4 The mitochondria ultrastructural changes of U937 cells
A、B：正常U937細(xì)胞；C、D：50 μmol/L H2O2處理后U937細(xì)胞。A、C：×10 000；B、D：×30 000。

圖5 U937細(xì)胞內(nèi)ROS活性

Fig.5 ROS activities of U937 cells (×40)
A：對(duì)照組；B：50 μmol/L H2O2；C：50 μmol/L H2O2+20 U/L SOD；D：50 μmol/L H2O2+100 U/L SOD；E：50 μmol/L H2O2+300 U/L SOD。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度SOD作用后U937細(xì)胞線粒體膜電位的變化

線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1在線粒體內(nèi)形成多聚體，其發(fā)射光為紅色熒光；細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜電位下降，JC-1以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。正常U937細(xì)胞綠色熒光較弱，紅色熒光較強(qiáng)，即正常U937細(xì)胞存在少量凋亡細(xì)胞；50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)，即H2O2作用U937細(xì)胞后細(xì)胞增殖旺盛，線粒體膜電位升高；不同抗氧化劑作用細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降。隨著SOD濃度增大，紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)(圖6)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，50 μmol/L H2O2組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)；不同濃度SOD作用后，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與50 μmol/L H2O2組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

圖6 不同濃度SOD作用后U937細(xì)胞線粒體膜電位變化

Fig.6 Mitochondrial membrane potential changes of U937 cells treated with different concentrations of SOD
A：對(duì)照組；B：50 μmol/L H2O2；C：50 μmol/L H2O2+20 U/L SOD；D：50 μmol/L H2O2+100 U/L SOD；E：50 μmol/L H2O2+300 U/L SOD。

2.7 EdU檢測(cè)不同濃度SOD作用后U937細(xì)胞增殖變化

EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖中，紅色熒光代表新合成的DNA，藍(lán)色熒光代表Hoechst染色后的細(xì)胞核。與正常U937細(xì)胞增殖相比較，50 μmol/L H2O2作用于U937細(xì)胞后細(xì)胞增殖旺盛，紅色熒光較多，即新合成的DNA多。給予不同濃度抗氧化劑后細(xì)胞增殖減慢，紅色熒光減弱，新合成的DNA減少。隨著SOD濃度增大，紅色熒光減弱，表明SOD抑制50 μmol/L H2O2處理后U937細(xì)胞DNA合成(圖8)。50 μmol/L H2O2組的EdU標(biāo)記U937細(xì)胞增殖與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)；與50 μmol/L H2O2比較，不同濃度SOD作用后細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)。

圖7 不同濃度SOD作用后U937細(xì)胞的早期凋亡率

Fig.7 Early apoptosis rate of U937 cells treated with different concentrations of SOD

與對(duì)照組(control)比較，*P<0.05 ；與50 μmol/L H2O2組比較，#P<0.05。

3 討 論

有研究表明細(xì)胞的存亡取決于氧化還原微環(huán)境中的ROS水平。低水平的ROS能促進(jìn)細(xì)胞增殖，亞致死水平的ROS導(dǎo)致正?；虬┣凹?xì)胞DNA損傷從而促進(jìn)惡變，而過(guò)高的ROS水平可促進(jìn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度H2O2作用于急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株，經(jīng)MTT法、光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)低濃度(50 μmol/L)H2O2刺激U937細(xì)胞增殖，活細(xì)胞數(shù)量增多，而200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，隨著H2O2濃度增大至大于500 μmol/L時(shí)，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞變形并出現(xiàn)細(xì)胞碎片，死亡細(xì)胞明顯增多。進(jìn)一步證實(shí)了H2O2對(duì)細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的雙向調(diào)節(jié)作用[10-11]。通過(guò)給予U937細(xì)胞不同濃度H2O2作用不同時(shí)間，檢測(cè)U937細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化發(fā)現(xiàn)，隨H2O2濃度增大，時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量不斷增加。同時(shí)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常U937細(xì)胞呈圓形，外觀規(guī)則，細(xì)胞表面突起，核漿比例高，核染色質(zhì)豐富、分布均勻。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多細(xì)胞器，線粒體形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整。50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量多，大小均勻，呈圓形，線粒體腫脹，嵴排列紊亂，部分可見(jiàn)嵴溶解，染色質(zhì)輕度凝集。這與前期研究中，透射電鏡觀察初發(fā)、復(fù)發(fā)M5患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化一致[5]。因此，我們用低濃度H2O2刺激U937細(xì)胞增殖模擬急性單核細(xì)胞白血病M5復(fù)發(fā)時(shí)的高增殖狀態(tài)。

圖8 EdU檢測(cè)U937細(xì)胞增殖熒光圖

Fig.8 U937 cell proliferation fluorescence diagram by EdU

A：對(duì)照組；B：50 μmol/L H2O2；C：50 μmol/L H2O2+20 U/L SOD；D：50 μmol/L H2O2+100 U/L SOD；E：50 μmol/L H2O2+300 U/L SOD。

圖9 EdU標(biāo)記U937細(xì)胞增殖變化

Fig.9 U937 cell proliferation changes by EdU marker

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與50μmol/L H2O2組比較，#P<0.05。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，急性單核細(xì)胞白血病患者細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，隨著細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高，氧化能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶清除過(guò)量ROS，消耗了抗氧化物酶，機(jī)體的抗氧化防御能力減弱，而化療緩解患者體內(nèi)抗氧化物酶活性相比原發(fā)組、復(fù)發(fā)組升高，但仍低于正常對(duì)照組，表明血漿中抗氧化物酶的活性與病情有關(guān)[5]。且有研究表明給予抗氧化劑消除過(guò)多ROS可逆轉(zhuǎn)過(guò)多ROS引起的細(xì)胞衰老和細(xì)胞功能下降[12]。本實(shí)驗(yàn)選用抗氧化劑SOD，發(fā)現(xiàn)其對(duì)增多的ROS引起增殖旺盛的U937細(xì)胞有增殖抑制作用。

SOD是一種內(nèi)源性抗氧化劑，能抵御O2-·對(duì)細(xì)胞的破壞。外源性SOD可能通過(guò)強(qiáng)化機(jī)體抗氧化保護(hù)系統(tǒng)而達(dá)到有效的保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道SOD基因的低表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生，維持其惡性增殖，SOD可能與抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，合成能量并參與細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體膜電位(ΔΨm)會(huì)發(fā)生變化?？梢酝ㄟ^(guò)線粒體ΔΨm觀察線粒體通透性，并能很好地評(píng)價(jià)線粒體的功能[14-15]，當(dāng)細(xì)胞受到損害時(shí)，MPTP開(kāi)放，造成線粒體ΔΨm下降和細(xì)胞內(nèi)生物合成破壞，細(xì)胞能量代謝障礙，并通過(guò)ROS產(chǎn)生、氧化磷酸化及鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等多種途徑進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷。可見(jiàn)檢測(cè)線粒體膜電位的變化具有重要意義[16]。JC-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種高度特異性的線粒體熒光染料，對(duì)ΔΨm具有更高的敏感性，特異性更強(qiáng)，結(jié)果更可靠[17]。5-乙炔基-2，脫氧尿嘧啶核苷( EdU)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)取代脫氧胸腺嘧啶核苷插入到新合成的DNA之中，可以高效、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)新合成的DNA，有效地檢測(cè)S期細(xì)胞的百分比[18-19]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常的U937細(xì)胞內(nèi)存在少量的ROS，線粒體膜電位低，即正常U937細(xì)胞存在少量凋亡細(xì)胞。50 μmol/L H2O2處理U937細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，細(xì)胞增殖旺盛，線粒體膜電位升高，凋亡率減少，新合成的DNA增多。加入不同濃度SOD作用，結(jié)果顯示隨著SOD濃度的升高，ROS含量減少，表現(xiàn)出劑量依賴性，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞增殖減慢，新合成的DNA減少。由此推斷，50 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞內(nèi)ROS增多，增多的ROS刺激細(xì)胞增殖，給予抗氧化劑后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量減少，細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加。

綜上所述，低濃度H2O2刺激U937細(xì)胞增殖，考慮與細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加有關(guān)。抗氧化劑SOD對(duì)抗H2O2對(duì)U937細(xì)胞的增殖作用，其機(jī)制與減輕細(xì)胞內(nèi)ROS水平、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平有關(guān)。這提示當(dāng)白血病細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生過(guò)量時(shí)，補(bǔ)充外源性的抗氧化劑可以彌補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力的不足并清除活性氧，抑制細(xì)胞增殖。因此，抗氧化劑有望成為治療白血病的有效藥。

[1] FINKEL T. Oxidant signals and oxidative stress[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(2):247-254.

[2] ZHANG Y, DU Y, LE W, et al. Redox control of the survival of healthy and diseased cells[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15(11):2867-2908.

[3] D’AUTREAUX B, TOLEDANO MB. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(10):813-824.

[4] DICKINSON BC, CHANG CJ. Chemistry and biology of reactive oxygen species in signaling or stress responses[J]. Nat Chem Biol, 2011,7(8):504-511.

[5] 白改改，路晨陽(yáng)，申秋菊，等. 氧自由基在急性單核細(xì)胞白血病發(fā)病中的作用[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2015, 36(4):501-504.

[6] NIEBOROWSKA-SKORSKA M, KOPINSKI PK, RAY R, et al. Rac2-MRC-cIII-generated ROS cause genomic instability in chronic myeloid leukemia stem cells and primitiveprogenitors[J]. Blood, 2012, 119(18):4253-4263.

[7] ZHOU F, SHEN Q, CLARET FX. Novel roles of reactive oxygen species in the pathogenesis of acute myeloid leukemia[J]. J Leukoc Biol, 2013, 94(3):423-429.

[8] ZHOU FL, ZHANG WG, WEI YC, et al. Involvement of oxidative stress in the relapse of acute myeloid leukemia[J]. J Biol Chem, 2010, 285(20):15010-15015.

[9] REDDY MM, FERNANDES MS, SALQIA R, et al. NADPH oxidases regulate cell growth and migration in myeloid cells transformed by oncogenic tyrosine kinases[J]. Leukemia, 2011, 25(2):281-289.

[10] CAIRNS RA, HARRIS IS, MAK TW. Regulation of cancer cell metabolism[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(2):85-95.

[11] TOYOKUNI S. Novel aspects of oxidative stress-associated carcinogenesis[J]. Antioxid Redox Signa, 2006, 8(7-8):1373-1377.

[12] JEONG SG, CHO GW. Endogenous ROS levels are increased in replicative senescence in human bone marrow mesenchymal stromal cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 460(4):971-976.

[13] BRAVARD A, SABATIER L, HOFFSCHIR F, et al. SOD2: a new type of tumor-suppressor gene?[J]. Int J Cancer, 1992, 51(3):476-480.

[14] BURDON RH. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation[J]. Free Radic Biol Med, 1995, 18(4):775-794.

[15] CHENAIS B, ANDRIOLLO M, GUIRAUD P, et al. Oxidative stress involvement in chemically induced differentiation of K562 cells[J]. Free Radic Biol Med, 2000, 28(1):18-27.

[16] GEIGER LK, KORTUEM KR, ALEXEJUN C, et al. Reduced redox state allows prolonged survival of axotomized neonatal retinal ganglion cells[J]. Neuroscience, 2002, 109(3):635-642.

[17] PROVINCIALI M, DONNINI A, ARGENTATI A, et al. Reactive oxygen species modulate Zn(2+)-induced apoptosis in cancer cells[J]. Free Radic Biol Med, 2002, 32(5): 431-445.

[18] ZENG C, PAN F, JONES LA, et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system[J]. Brain Res, 2010, 1319:21-32.

[19] YU Y, ARORA A, MIN W, et al. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations[J]. J Immunol Methods, 2009, 350(1/2):29-35.

(編輯 國(guó) 榮)

Effect of antioxidants on the proliferation of acute monocytic leukemia cells treated with hydrogen peroxide

LU Chen-yang1, BAI Gai-gai1, SHEN Qiu-ju1, MENG Shan1, HUI Ling-yun2,SU Dan1, ZHANG Wang-gang1, ZHOU Fu-ling1

(1. Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To observe the antioxidant effect on the proliferation of acute monocytic leukemia cells by establishing its reactive oxygen species (ROS) cell model. Methods U937 cell treated with different concentrations of hydrogen peroxide (H2O2) was used to establish ROS cell model. The proliferative cells were treated with various concentrations of antioxidant superoxide dismutase (SOD). We detected cell proliferation, intracellular content of ROS and mitochondrial membrane potential changes. Results (1) Low concentration of H2O2(50 μmol/L) stimulated the proliferation of U937 cells while high concentration of H2O2(500 μmol/L) produced a toxic effect on the cells. U937 cells were treated with 50 μmol/L of H2O2for 48 hours to establish the experimental model. (2) U937 cells contained a small amount of ROS and apoptotic cells; after 50 μmol/L H2O2treatment, the content of intracellular ROS, the mitochondrial membrane potential, cell proliferation and the newly synthesized DNA were increased, but the apoptosis rate declined. After treatment with various concentrations of antioxidants superoxide dismutase (SOD), the content of intracellular ROS, the mitochondrial membrane potential and the newly synthesized DNA decreased, and cell proliferation slowed down while the apoptosis rate was increased, which showed a dose-dependent manner. Conclusion Antioxidants can inhibit the proliferation of acute monocytic leukemia cells in a dose-dependent manner.

acute monocytic leukemia; reactive oxide species (ROS); antioxidant; cell proliferation; mitochondrial membrane potential; superoxide dismutase (SOD)

2015-05-22

2015-09-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270597)；2011年中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.0602-08143041) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81270597) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities in 2011(No.0602-08143041)

周芙玲. E-mail: zhoufuling@163.com

R733.7

A

10.7652/jdyxb201601007

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1653.004.html(2015-12-08)