薄雙玲，田 鶴，閻麗菁，趙 寬，馬太芳

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山西汾陽 032200；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

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水通道蛋白-1在小鼠腎小管發(fā)育中的表達(dá)

薄雙玲1，田 鶴2，閻麗菁2，趙 寬1，馬太芳1

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山西汾陽 032200；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

目的 觀察水通道蛋白1(aquaporin-1, AQP-1)在小鼠腎小管發(fā)育過程中的時空性表達(dá)，探討AQP-1與腎小管發(fā)育的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合體視學(xué)方法和免疫印跡法，測定不同胚齡(E)12、14、17、18 d 及生后日齡(P)1、3、7、14、24、40、70 d小鼠腎小管內(nèi)AQP-1的表達(dá)及其含量變化。結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示AQP-1在E14 d髓質(zhì)部位發(fā)育中的小管即有表達(dá)，之后主要表達(dá)在近端小管、髓袢降支細(xì)段的管腔膜和側(cè)基底膜，生腎區(qū)則無陽性表達(dá)。圖像分析和體視學(xué)測量顯示隨著胚齡的增加，AQP-1在腎小管表達(dá)逐漸增強后趨于穩(wěn)定；免疫印跡法顯示AQP-1在腎臟的表達(dá)量在P 7 d達(dá)到高峰后趨于穩(wěn)定。結(jié)論 AQP-1在腎小管的發(fā)育過程中存在時空性表達(dá)，對腎小管的發(fā)育和成熟起關(guān)鍵作用。

水通道蛋白-1；腎；發(fā)育；小鼠

水通道蛋白-1(aquaporin-1, AQP-1)屬于水通道蛋白家族，廣泛分布于機體組織細(xì)胞中，尤其在與體液分泌和吸收有關(guān)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量豐富，參與水的吸收、分泌以及細(xì)胞內(nèi)外體液平衡的調(diào)節(jié)[1]。已有研究表明，AQP-1在成年大鼠腎臟主要定位于近端小管的管腔膜和側(cè)基底膜，以及髓袢降支細(xì)段和直小血管袢，在尿液的濃縮中起重要作用[2]。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于AQP-1的研究主要集中在它與腎積水、多囊腎、腎臟腫瘤等疾病之間的關(guān)系[3-4]。關(guān)于AQP-1與腎發(fā)育方面的研究則少見報道。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合體視學(xué)方法及免疫印跡法檢測AQP-1在小鼠腎小管發(fā)育過程中的時空表達(dá)及其含量變化,以探討AQP-1與腎小管發(fā)育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 取材及標(biāo)本制備

取成年健康昆明小白鼠，按雌雄1∶1同窩飼養(yǎng)，每日早晚8∶00時查看雌鼠妊娠情況，觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡(embryonic days, E)0 d。孕鼠分籠飼養(yǎng)2周開始每日早晚8∶00時各查看1次仔鼠出生情況，以仔鼠出生的最早時間計為生后(postnatal, P)0 d。孕鼠分為11組，每組4只，每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠(即每組8只胎鼠或仔鼠)，分別取胚齡12、14、17、18 d胎鼠和生后1、3、7、14、24、40、70 d仔鼠腎。孕鼠經(jīng)100 g/L水合氯醛麻醉，剖腹取出胎鼠，胚齡12 d全胚固定，胚齡14、17、18 d取其左腎固定。仔鼠麻醉后，于腹后壁取出左腎，用排刀法沿橫軸將腎切開，入40 g/L多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，香柏油透明，石蠟定向包埋，做厚4 μm連續(xù)切片。右腎入丙酮迅速冷凍，-80 ℃保存，以備免疫印跡法測定用。

1.2 試劑

兔抗小鼠AQP-1多克隆抗體購自Santa公司；Post Vaccination(PV)兔試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒、Polyvinylidene Fluoride(PVDF)膜、胎牛血清、Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)等免疫印跡試劑均購自Sigma公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色、灰度評分及體視學(xué)測定

石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)微波修復(fù)10 min后室溫冷卻，加30 mL/L H2O2室溫孵育10 min去除過氧化物酶，羊血清封閉15 min，滴加AQP-1一抗(濃度1∶200)4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育15 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶室溫15 min，DAB顯色2 min。脫水、透明、封固，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照。

AQP-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果應(yīng)用 CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每個標(biāo)本間隔選取5張切片，每張切片按“S”形隨機選取5個陽性視野，在400倍光鏡下，以切片背景色作為參照進(jìn)行分析。以灰度值來表示AQP-1的表達(dá)量，灰度值越大，AQP-1表達(dá)量越少。

每個標(biāo)本等間隔選取5張切片，每張切片在油鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統(tǒng)，交點計數(shù)法分別測算腎小管陽性反應(yīng)表達(dá)的面密度值，公式為：Sv=2Ix/Lc(Lc=ΣPc·a)，式中Ix為陽性表達(dá)的胞膜與測試方格的交點數(shù)，Pc為測試系統(tǒng)落在參照系(腎小管)的點數(shù)，a為方格的兩點間距離，相當(dāng)于實際長度的0.1 mm。

1.4 免疫印跡法

各組小鼠取冷凍待用的右腎，加入3倍體積的裂解液，碾磨后0 ℃靜置2 h，離心收集上清，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量。每個樣品取25 μg濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。100 g/L脫脂奶粉封閉，AQP-1抗體(稀釋度1∶200)4 ℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶600)室溫孵育1 h，BCIP/NBT試劑顯色，掃描電泳條帶，用Gene Tools軟件分析電泳條帶吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)顯示陽性反應(yīng)物為棕黃色。AQP-1在E12 d胎鼠腎中未見陽性表達(dá)，E14 d的胎鼠腎髓質(zhì)部位可見大量的間質(zhì)和發(fā)育中的腎小管，部分腎小管管腔膜和側(cè)基底膜可見陽性表達(dá)，而生腎區(qū)則無表達(dá)(圖1A)。E17 d出現(xiàn)髓質(zhì)，可見近直小管管腔膜和側(cè)基底膜均有較強陽性表達(dá)，而皮質(zhì)中未發(fā)育完善的近曲小管，管腔不明顯，陽性表達(dá)彌散于胞質(zhì)中(圖1B)。E18 d出現(xiàn)明顯的髓放線，但髓放線中未見明顯的陽性表達(dá)，髓質(zhì)中可見近直小管、髓袢降支細(xì)段強陽性表達(dá)，近曲小管胞質(zhì)中陽性反應(yīng)物也逐漸邊集在管腔膜和側(cè)基底膜(圖1C)。P1 d、P3 d出現(xiàn)腎乳頭，乳頭處髓袢降支細(xì)段、髓放線中近直小管以及皮質(zhì)中近曲小管均見強陽性表達(dá)(圖1D)。從P7 d至P70 d，生腎區(qū)消失，AQP-1在腎臟中表達(dá)最多，主要定位在近端小管，髓袢降支細(xì)段以及直小血管降支(圖1E、1F)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色灰度評分結(jié)果

隨著腎臟的發(fā)育，AQP-1表達(dá)的灰度值在腎小管為逐漸減小，P7d后趨于平穩(wěn)(圖2)。各組數(shù)值與背景(230.475±3.471)比較均有顯著性差異(P<0.05)。這說明AQP-1在腎小管的表達(dá)隨胚日齡的增加逐漸增強后趨于穩(wěn)定。

2.3 體視學(xué)測量結(jié)果

隨著胚日齡的增加，AQP-1在腎小管的面密度值逐漸增加，P24 d后趨于穩(wěn)定，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與前一組數(shù)值比較有顯著性差異(P<0.05，圖3)。

2.4 免疫印跡法測定結(jié)果

應(yīng)用Gene Tools軟件對AQP-1蛋白表達(dá)電泳條帶的分析顯示，隨著腎的發(fā)育AQP-1在小鼠腎組織的吸光度值逐漸增加，P7d達(dá)到頂峰后趨于穩(wěn)定。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組間數(shù)值的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05(圖4)。

圖1 AQP-1在小鼠不同發(fā)育階段腎小管的表達(dá)

Fig.1 Immunohistochemical staining showed AQP-1 expression in the developing renal tubules
A：E14 d, ×200；B：E17 d, ×200；C：E18 d, ×200；D：P1 d, ×200；E：P7 d, ×400；F：P70 d, ×400。

圖2 小鼠不同發(fā)育階段AQP-1在腎小管表達(dá)的灰度值

Fig.2 Gray scale of AQP-1 in the developing renal tubules
與前一組比較,*P<0.05,n=200。

圖3 小鼠發(fā)育各階段腎小管AQP-1陽性表達(dá)的面密度值(μm-1)

Fig.3 Surface area density of AQP-1 in all stages of renal tubules (μm-1)
與前一組比較,*P<0.05,n=200。

圖4 小鼠發(fā)育過程中腎內(nèi) AQP-1 表達(dá)的免疫印跡結(jié)果

Fig.4 Expression of AQP-1 in the development mouse kidney detected by immunoblot
與前一組比較，*P<0.05,n=10。A：免疫印跡蛋白條帶；B：AQP-1在小鼠腎組織的A值變化。

3 討 論

在腎臟至少有7個水通道蛋白(AQP1、2、3、4、6、7和11)，它們參與了水平衡的調(diào)節(jié)，以及水平衡障礙有關(guān)疾病的病理生理過程。其中AQP-1為膜鑲嵌式水分子通道蛋白，是一個存在于哺乳動物中的只傳輸水分子的典型水通道蛋白，有高度保守性，AQP-1在成鼠腎臟滲透性重吸收水中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。

為探討AQP-1與腎小管發(fā)育之間的關(guān)系，本實驗通過免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合體視學(xué)方法及免疫印跡技術(shù)檢測AQP-1在小鼠腎小管發(fā)育過程中的表達(dá)及其含量變化。研究結(jié)果顯示，在胚胎12 d時，沒有AQP-1的陽性表達(dá)，這表明在輸尿管芽與生后腎組織相互誘導(dǎo)分支過程中沒有AQP-1參與。胚胎14 d，腎臟已經(jīng)形成完整的包膜，能夠形成尿液，而髓質(zhì)部位小管陽性表達(dá)則說明此時的腎臟已具備重吸收功能，胚胎17 d，發(fā)育中的近端小管管腔膜和側(cè)基底膜可見其陽性表達(dá)，而皮質(zhì)中發(fā)育中的近端小管表達(dá)部位彌散，散在于胞質(zhì)中，這說明隨著近端小管的發(fā)育，管腔出現(xiàn)，AQP-1逐漸從小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)到其管腔膜和側(cè)基底膜，即為近端小管重吸收功能逐漸完善的過程，故推斷AQP-1在腎小管功能的完善中起關(guān)鍵作用。胚胎18 d時可以看到明顯的髓放線，但此時近直小管還處于發(fā)育早期，故髓放線中AQP-1的陽性表達(dá)不顯著。P1 d到P7 d，AQP-1表達(dá)量逐漸增多，不僅表達(dá)在近曲、近直小管，而且在髓袢降支細(xì)段，直小血管降支都有強陽性表達(dá)，這與前人關(guān)于哺乳動物的研究結(jié)果是一致的[7-8]，從而也說明AQP-1不僅對近端小管重吸收水分起關(guān)鍵作用，而且對于逆流倍增機制的形成和發(fā)揮作用也至關(guān)重要。AQP-1從胚胎14 d開始在腎小管的表達(dá)逐漸增強，隨著生后7 d生腎區(qū)消失，腎小管的表達(dá)達(dá)到頂峰，而腎小管AQP-1表達(dá)的面密度值還在繼續(xù)增加，生后24 d之后趨于平穩(wěn)，推斷這是由于在從P7d到P24 d期間，發(fā)育中的腎小管AQP-1從胞質(zhì)逐漸表達(dá)到管腔膜和側(cè)基底膜。

已有研究表明，AQP-1在腎臟的定位和水的滲透性特征是一致的，靶基因敲除小鼠近端小管水的重吸收比正常小鼠減少了8倍，從而也更直觀的反映了AQP-1在水重吸收和尿生成中的作用[5]。HAN等[1]認(rèn)為，AQP-1的調(diào)節(jié)大致可以分為兩種方式：一種是調(diào)節(jié)AQP-1的活性，它可以磷酸化為CAMP依賴性，從而活化蛋白激酶A或C，催化水通道蛋白上的絲氨酸磷酸化，進(jìn)一步增加膜對水的通透性；另一種是通過改變細(xì)胞膜上AQP-1的含量來調(diào)節(jié)跨膜水流動。依據(jù)本研究結(jié)果推測，在腎小管發(fā)育過程中，AQP-1主要是通過后者來發(fā)揮作用的，尤其是在生后7 d到生后24 d，小管上皮細(xì)胞膜上AQP-1的表達(dá)逐漸增強，腎小管的重吸收功能以及尿液濃縮的能力顯著增強。所以，我們猜想AQP-1在腎胚胎發(fā)育中主要和后期腎小管重吸收功能的發(fā)育完善有關(guān)。

綜上所述，在腎小管發(fā)育過程中，AQP-1的表達(dá)呈一定的時空分布性，這與腎臟在不同發(fā)育階段對水的重吸收能力，以及髓袢對尿液的濃縮能力密切相關(guān)，有學(xué)者證實[9]，生后3周的大鼠失水8 h后，其尿液最高的滲透壓僅是成年大鼠50%的水平，這也說明腎臟在出生后的很長一段時間，功能才逐步完善。然而，關(guān)于這一現(xiàn)象的分子調(diào)節(jié)機制還有待于我們進(jìn)一步研究。

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(編輯 韓維棟)

Expression of AQP-1 in the developing renal tubules of mice

BO Shuang-ling1, TIAN He2, YAN Li-jing2, ZHAO Kuan1, MA Tai-fang1

(1. Department of Histology and Embryology, Fenyang College of Shanxi Medical University, Fenyang 032200; 2. Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, China)

Objective To observe the temporal and spatial expression of aquaporin-1 (AQP-1) in the developing renal tubules of mice so as to investigate the relationship between AQP-1 and development of renal tubules. Methods The expression and content of AQP-1 in the renal tubules of mice were examined by immunohistochemistry, stereological method and Western blot at embryonic days 12, 14, 17 and 18, as well as postnatal days 1, 3, 7, 14, 24, 40 and 70. Results Immunohistochemical analysis showed that AQP-1 was expressed in the developing tubules at embryonic day 14. After that it was localized on the apical and basolateral surfaces of the proximal convoluted tubules, the descending thin limbs of the loop of Henle. However, AQP-1 was not observed in the nephrogenic zone. The results of image analysis and stereology showed that during tubular development the expression of AQP-1 was increased first and then remained stable. Western blot showed that AQP-1 expression reached the peak at postnatal day 7 and then remained stable. Conclusion The expression of AQP-1 in the developing renal tubules of mice shows chronological and spatial sequence, indicating that it might play a key role in the development and maturation of renal tubules.

aquaporin-1 (AQP-1); kidney; development; mouse

2015-04-08

2015-05-06

遼寧省自然科學(xué)基金項目(No.2013022011)，遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L2013331) Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Province (No.2013022011) and the Research Project Fund of Liaoning Provincial Department of Education(L2013331)

馬太芳. E-mail: taifangma@sohu.com

R329

A

10.7652/jdyxb201601011

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1639.016.html(2015-12-09)