張金璐，陳新林，呂海俠，劉 勇，羅國剛

(西安交通大學：1. 第一附屬醫(yī)院神經內科，陜西西安 710061；2. 醫(yī)學部神經生物學實驗室，陜西西安 710061)

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c-Jun氨基末端激酶信號通路參與電刺激大鼠三叉神經節(jié)偏頭痛模型降鈣素基因相關肽表達調控

張金璐1，陳新林2，呂海俠2，劉 勇2，羅國剛1

(西安交通大學：1. 第一附屬醫(yī)院神經內科，陜西西安 710061；2. 醫(yī)學部神經生物學實驗室，陜西西安 710061)

目的 探究c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-Terminal Kinase, JNK)信號轉導通路對電刺激大鼠三叉神經節(jié)(TG)偏頭痛模型中降鈣素基因相關肽(CGRP)表達調控的作用。方法 成年雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、假手術組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組。采用電刺激大鼠單側TG制作偏頭痛模型，選擇JNK信號通路特異性阻滯劑SP600125為干預藥物。觀察偏頭痛造模前后的行為學變化。各組大鼠處理后24 h，Western blot檢測TG中磷酸化JNK蛋白(p-JNK)和JNK蛋白表達量并計算磷酸化比率，免疫組織化學染色檢測CGRP表達量。結果 大鼠造模后前肢撓頭次數(shù)增加、爬籠次數(shù)減少(P<0.05)。模型組、假手術組、DMSO+模型組、SP25+模型組大鼠TG內p-JNK比率較空白對照組明顯升高(P<0.05)；SP50+模型組TG內p-JNK比率較模型組、SP25+模型組明顯降低(P<0.05)；模型組TG內CGRP表達量較空白對照組、SP50+模型組明顯升高(P<0.05)；模型組刺激側TG內CGRP表達量明顯高于未刺激側。結論 電刺激大鼠單側TG可使偏頭痛急性發(fā)作過程中關鍵的神經血管活性肽CGRP表達升高，引發(fā)大鼠行為學變化，且JNK信號通路參與了TG內CGRP的表達調控過程。

偏頭痛；三叉神經節(jié)；降鈣素基因相關肽(CGRP)；JNK；SP600125

偏頭痛是神經科一種常見的慢性復發(fā)性疾病，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔。偏頭痛的發(fā)病機制尚未完全闡明。較為廣泛接受的是三叉神經-血管學說[1]，電刺激大鼠三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion, TG)可以誘發(fā)三叉神經支配區(qū)血漿蛋白外滲[2]、以降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)為代表的血管活性肽類物質釋放增加，局部腦膜血流變化等非特異性炎癥反應[3-4]。偏頭痛發(fā)作與血清內CGRP水平變化的顯著相關性是三叉神經-血管學說的核心[5]。本研究前期實驗證實細胞內有絲分裂型細胞內絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路中的ERK1/2和C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路均參與了TG離體培養(yǎng)后CGRP表達上調[6]。本研究旨在探究JNK信號通路對電刺激大鼠TG偏頭痛模型中CGRP表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

同心圓電極(Microprobes公司)；CGRP特異性抗體(Abcam公司，1∶400)；c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)特異性抗體(CST公司，1∶10 000)；JNK信號通路特異性抑制劑SP600125(CST公司)10 mg，溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成母液，濃度為25 mmol/L，-20 ℃保存，工作液仍使用DMSO稀釋，推薦濃度為20～50 μmol/L。

1.2 動物分組及電刺激TG偏頭痛模型制作

選擇SPF級SD雄性大鼠54只，體質量300～400 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，并獲得西安交通大學動物實驗管理委員會批準。

造模電刺激TG偏頭痛模型方法為：100 g/L水合氯醛全身麻醉大鼠并固定，頭頂正中剪毛、“十”字切開皮膚，刮除軟組織暴露顱骨表面，標記前囟；利用立體定位儀定位右側(刺激側)前囟后3.2 mm、旁開3.0 mm位置，牙科鉆鉆孔，緩慢將電極插入，深度約9.5～10 mm；連接同心圓電極-導線-電流輸出裝置，調整恒定輸出電流1 mA，周期200 ms，波寬5 ms，持續(xù)時間5 min[3-4,7]；刺激結束后，將電極緩慢垂直提拉拔出電極，縫合頭皮切口并擦涂紅霉素軟膏。大鼠側臥至麻醉復蘇。觀察大鼠的行為學變化。

將大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組。對照組不做任何手術處理或者藥物干預；假手術組僅在電刺激部位使用牙科鉆打孔，電極插入5 min但不進行電刺激；其余各組均造模，其中模型組僅進行電刺激TG偏頭痛造模；DMSO+模型組同時進行干預藥物SP600125的溶劑DMSO側腦室注射；SP50+模型組、SP25+模型組同時分別進行干預藥物50、25 μmol/L SP600125側腦室注射。

1.3 免疫組織化學法檢測CGRP表達

將大鼠用40 g/L多聚甲醛灌注固定，解剖TG進行冰凍切片，晾干于4 ℃保存。濕盒中復溫、PBS溶液浸泡后，用3 mL/L Triton X-100浸泡30 min、PBS沖洗后使用30 mL/L H2O2溶液浸泡10 min并沖洗。用100 mL/L山羊血清室溫封閉1 h，棄去擦干，滴加1∶400兔抗大鼠CGRP抗體，室溫孵育2 h后4 ℃過夜。次日滴加羊抗兔二抗試劑、辣根過氧化物酶試劑，室溫分別孵育2 h后沖洗、擦干。配制DAB顯色，脫水、透明、封片。每組選擇>6張10倍鏡圖片，使用Image-Pro Plus 5.0進行平均吸光度值(AA)和累積吸光度值(IA)分析。

1.4 Western blot檢測p-JNK和JNK表達

將大鼠使用冰生理鹽水灌注固定，解剖TG，提取蛋白并煮樣，進行電泳，設置參數(shù)80 V，30 min；120 V，2 h。轉膜后，將PVDF膜置于牛奶中室溫封閉2 h。使用PBST稀釋一抗(1∶10 000)，封膜后室溫孵育2 h、4 ℃搖床過夜。次日加二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。結束后PBST洗膜，暗室內顯影。對膠片使用Image J 2X軟件進行灰度值(DPI)分析，并利用獲得數(shù)據(jù)計算每組p-JNK比率。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 偏頭痛模型對大鼠行為學的影響

圖1 電刺激大鼠三叉神經節(jié)模型塑造前后的大鼠行為學變化

Fig.1 Rats’ behavioral changes before and after the model surgery
A：平均前肢撓頭次數(shù)；B：平均爬籠次數(shù)；C：平均過度理毛次數(shù)。與造模前比較，*P<0.05。

2.2 偏頭痛模型及SP600125對JNK磷酸化的影響

各組大鼠分別干預24 h后，用Western blot檢測TG內JNK與p-JNK，并進行灰度值(DPI)分析，進一步計算p-JNK/JNK比率，并進行單因素方差分析。結果顯示，與空白對照組相比，假手術組、模型組、DMSO+模型組大鼠TG內p-JNK比率明顯升高(P值分別為0.049、0.017、0.009)；假手術組較對照組p-JNK比率明顯升高(P=0.049)，而與模型組之間無明顯差異(P=0.628)，但無超過模型組趨勢；SP50+模型組TG內p-JNK比率較模型組明顯降低(P=0.047)，而SP25+模型組無此趨勢(P=0.325，圖2)。

2.3 偏頭痛模型及SP600125對TG內CGRP表達的影響

取空白對照組、模型組以及SP50+模型組各6只大鼠TG進行免疫組織化學染色，并進行AA和IA分析顯示，模型組TG內CGRP IA明顯高于對照組(P=0.000)和SP50+模型組(P=0.000)，而SP50+模型組與空白對照組無明顯差異(P=0.807)。3組之間比較AA差異均無統(tǒng)計學意義(圖3、4)。另外，對于模型組大鼠右(刺激側)、左(未刺激側)TG內CGRP表達情況進行檢測，右側(刺激側)CGRP表達情況明顯高于左側(未刺激側)，P=0.002(圖4)。

圖2 各組大鼠TG內JNK和p-JNK表達及p-JNK/JNK比率變化

Fig.2 The expressions of p-JNK and JNK and the ratio of p-JNK/JNK in each group
A：1～6分別為對照組、假手術組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組；B：各組p-JNK/JNK比率：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.05。

圖3 三叉神經節(jié)內降鈣素基因相關肽(CGRP)免疫組織化學染色

Fig.3 The expression of CGRP in TG detected by immunohistochemistry (×10)
A：空白對照組；B：SP50+模型組(50 μmol/L SP600125)刺激側；C：模型組刺激側；D：模型組未刺激側(C中黑色箭頭所指為典型CGRP陽性細胞)。

圖4 三叉神經節(jié)內降鈣素基因相關肽(CGRP)免疫組織化學染色結果的統(tǒng)計學分析

Fig.4 The expression of CGRP in TG detected by immunohistochemistry
A：CGRP陽性染色AA比較；B：CGRP陽性染色IA比較，3組總體P=0.000，模型組明顯高于對照組(*P=0.000)和SP50+模型組(**P=0.000)，而對照組和SP50+模型組間無明顯差異(P=0.807)。C：模型組CGRP染色IA比較，刺激側明顯高于未刺激側，**P=0.002。

3 討 論

根據(jù)解釋偏頭痛發(fā)病機制的血管源性學說[8]、皮層擴散抑制學說[9]、三叉神經血管學說，研究人員分別構建出了多種偏頭痛動物模型。綜合考慮通路激活的特異性、實驗動物復制難易程度等因素，最終選擇以三叉神經血管學說為基礎的電刺激大鼠TG作為本研究的模型。

在三叉神經-血管學說中，偏頭痛發(fā)作時存在無菌性炎癥、TVS激活及血管舒縮異常等核心過程[10]，其中起到重要作用的是CGRP。實驗研究結果顯示，受到有效刺激后，三叉神經的反射活動引起CGRP釋放量增多可以導致偏頭痛發(fā)生[11]。CGRP在TG內含量最為豐富，其合成表達量可以作為判斷TG激活程度的標志，而在本研究相關的前期研究也證實，TG體外培養(yǎng)模型中，存在CGRP釋放增高[6,12-13]。在電刺激大鼠TG時，可以明顯看到刺激側的口鼻分泌物增多和咀嚼肌及眼肌收縮，提示電極對于TG形成了有效刺激。在后續(xù)的蛋白檢測中發(fā)現(xiàn)，刺激側的TG內CGRP表達明顯升高，與其他研究學者進行的研究結果一致[5,14]，證明了該模型科學有效模擬了TVS的激活過程。另外，模型組大鼠刺激側CGRP表達明顯高于未刺激側，說明起源于一側的TVS激活所導致的CGRP表達升高主要限于該側，這可能是偏頭痛呈現(xiàn)偏側發(fā)作的機制之一。

研究表明，多種大鼠偏頭痛模型會引起其行為學改變[15-17]，行為學結果顯示，電刺激后24 h，大鼠前肢撓頭次數(shù)明顯增加，爬籠次數(shù)明顯減少，過度理毛次數(shù)前后無明顯差異。分析該結果的原因可能為：為了完全消除麻藥對于行為學的影響，選擇了手術后24 h進行觀察。在這一過程中，TG損傷導致的TVS激活態(tài)而引起的生理不適持續(xù)存在，故前肢撓頭次數(shù)增加，而由于時間過久大鼠已經由躁狂多動狀態(tài)轉為抑郁，逃跑欲望不強烈，因而導致爬籠次數(shù)的減少。后期需進一步擴大樣本量、規(guī)范行為學觀察環(huán)境，完善該模型對于大鼠行為學影響的數(shù)據(jù)資料。

JNK系統(tǒng)是MAPK信號轉導系統(tǒng)的3條信號通路之一。本研究所在項目的前期實驗進行了以體外培養(yǎng)TG模型為基礎的研究，結果顯示離體TG內CGRP水平升高，而MAPK通路中的ERK1/2通路和JNK通路均參與了該調節(jié)過程，其中JNK信號通路起到了更為關鍵的作用[6]。因此本研究將調節(jié)CGRP表達的焦點定位于JNK信號通路。本研究結果顯示，電刺激TG可以激活JNK通路，并可被濃度50 μmol/L的SP600125所阻斷；而25 μmol/L濃度組卻未見明顯阻斷，提示SP600125的阻斷作用可能存在劑量依賴性。本研究的假手術組大鼠TG也存在部分JNK信號蛋白激活，可能與電極插入所帶來的機械性損傷有關，說明機械損傷可能也會激活JNK信號通路，機械刺激和電刺激可相互疊加，JNK信號通路的活化過程。

為了驗證JNK信號通路是否參與了CGRP表達的調控，本研究對比了模型組和SP50+模型組大鼠TG內CGRP的表達，結果顯示：模型組大鼠TG內CGRP陽性顆粒的累積吸光度值(IA)明顯高于SP50+模型組大鼠，提示JNK信號通路特異性阻斷劑SP600125可以阻斷CGRP的升高，提示JNK信號通路參與了電刺激大鼠TG所介導的CGRP的表達上調的調控過程。

綜合以上分析，認為該模型可以模擬偏頭痛發(fā)作過程，過程中存在JNK信號通路的激活，并介導了刺激側CGRP表達升高。目前偏頭痛的治療已經由單純干預血管舒張所引發(fā)的癥狀，發(fā)展為特異性阻斷CGRP受體來直接調節(jié)血管舒縮情況，其針對性、特異性、精細程度均有了長足的進步。本實驗在前期研究的基礎上，在大鼠活體水平證實了JNK信號通路參與偏頭痛發(fā)病過程中重要分子CGRP的表達調控，為進一步從分子水平研究安全有效的JNK抑制劑，從更上游水平阻斷甚至預防偏頭痛發(fā)病提供基礎研究數(shù)據(jù)。

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(編輯 國 榮)

The mechanism of c-Jun N-terminal kinase signaling transduction pathway in calcitonin gene-related peptide of rat migraine model via stimulating trigeminal ganglion by electrode

ZHANG Jin-lu1, CHEN Xin-lin2, Lü Hai-xia2, LIU Yong2, LUO Guo-gang1

(1. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061; 2. Laboratory of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the mechanism of c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling transduction pathway in calcitonin gene-related peptide (CGRP) of rat trigeminal ganglion (TG) migraine model. Methods We randomly divided adult male SD rats into control, sham-operation, model, DMSO+model, SP50+model, and SP25+model groups. We built the rat migraine model by stimulating TG with electrode and chose SP600125 as the intervention drug. We observed the behavior changes of rats before and after the surgery. The expressions of p-JNK and JNK protein were detected by Western blot, and the expression of CGRP in TG was detected by immunohistochemistry. Results After the stimulation, the number of times of head scratching was significantly higher than before (P<0.05) while the number of times of cage climbing was significantly lower than before (P<0.05). The ratio of p-JNK/JNK in TG was significantly higher in model, sham, DMSO+model, and SP50+model groups than in control group (P<0.05), while the ratio in SP50+model group was lower than that in model and SP25+model groups (P<0.05). The expression of CGRP in TG was significantly higher in model group than in control and SP50+model groups (P<0.05). Conclusion This rat migraine model can simulate the process of migraine attack, cause the model rats’ behavioral change and activate JNK signaling pathway. JNK signaling pathway participates in the regulation of the expression of CGRP in TG.

migraine; trigeminal ganglion (TG); calcitonin gene-related peptide (CGRP); Jun N-terminal kinase (JNK); SP600125

2015-05-19

2015-09-15

國家自然科學基金資助項目(No.81271127) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81271227)

羅國剛. E-mail: lguogang@163.com

R741

A

10.7652/jdyxb201601005

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1739.010.html(2015-12-08)