蘇立寧，宋小青，魏會(huì)平

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北張家口075000)

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神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的效果觀察及相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

蘇立寧，宋小青，魏會(huì)平

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北張家口075000)

目的 觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化的效果，并分析相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)。方法 將4周齡健康SD大鼠4只，脫臼處死取股骨分離BMSCs并傳代。取第5代 BMSCs制備細(xì)胞爬片，分為觀察組和對(duì)照組兩組，觀察組加入3% DMSO、60 ng/mL NGF 、DMEM/F12預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)誘導(dǎo)2 h，預(yù)誘導(dǎo)完成后加入100 ng/mL NGF、DMEM/F12誘導(dǎo)液誘導(dǎo)48 h。對(duì)照組不加任何藥物。誘導(dǎo)完成后倒置顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化，用免疫組化法檢測(cè)兩組BMSCs中的神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)蛋白，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)BMSCs中的NSE mRNA。采用生物信息學(xué)軟件STRING10.0分析NGF在誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中參與的蛋白網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中編碼蛋白的基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果 鏡下可見觀察組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核固縮，核質(zhì)比降低，細(xì)長(zhǎng)突起明顯，部分細(xì)胞間以網(wǎng)絡(luò)狀連接。對(duì)照組細(xì)胞密度較均勻，形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主。誘導(dǎo)完成第1、2、4 天，觀察組NSE mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.34±0.06、2.23±0.23、1.56±0.09，兩組比較，P均<0.05。觀察組誘導(dǎo)完成第1、2 天時(shí)NSE蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(35±8)、(133±6)個(gè)，對(duì)照組未檢測(cè)到NSE蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，兩組比較，P均<0.05。以NGF為種子節(jié)點(diǎn)得到與NGF直接發(fā)生作用的105個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)，共3個(gè)中心節(jié)點(diǎn)，分別為NGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體和泛素C。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果富集在神經(jīng)分化、神經(jīng)發(fā)育及調(diào)控神經(jīng)凋亡等生物學(xué)過(guò)程。NGF與Ras蛋白特定鳥嘌呤核苷酸釋放因子1、 腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、 生長(zhǎng)抑制蛋白、 NGF、NGFR、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶2、 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、 極微小蛋白激酶C、GTP結(jié)合蛋白R(shí)AC、核糖體蛋白S27A、 信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3、 酪氨酸羥化酶、 泛素A-52、泛素B和UBC等蛋白相互作用調(diào)控神經(jīng)分化過(guò)程。模塊分析結(jié)果顯示中心節(jié)點(diǎn)NGF、NGFR和UBC在模塊1中發(fā)揮核心的作用。結(jié)果 NGF可誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。以NGF為種子節(jié)點(diǎn)，篩選到105個(gè)與NGF直接發(fā)生互作的蛋白節(jié)點(diǎn)。NGF、NGFR和UBC在NGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的蛋白網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮核心作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；誘導(dǎo)分化；蛋白互作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種多能干細(xì)胞，取材方便。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 可向多種細(xì)胞及神經(jīng)樣細(xì)胞分化[1～4]，但BMSCs的分化機(jī)制復(fù)雜。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有調(diào)控神經(jīng)元分化、軸突生長(zhǎng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用[5～7]。NGF可誘導(dǎo)BMSCs分化為膽堿神經(jīng)細(xì)胞[8]，與功能受體TrkA結(jié)合，通過(guò)非Ras依賴途徑調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化[9]。目前沒(méi)有可誘導(dǎo)BMSCs分化為穩(wěn)定存活的神經(jīng)細(xì)胞的方法。2015年3～8月，我們采用NGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，并分析相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及儀器 4周齡健康SD雄性大鼠4只，由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定在河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室完成。飼養(yǎng)條件符合各等級(jí)動(dòng)物的衛(wèi)生質(zhì)量要求。

DMEM 、DMEM/F-12 培養(yǎng)基購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS) 購(gòu)自美國(guó)Life Technology 公司；NGF 購(gòu)自美國(guó)GenScript公司；RNA (TaKaRa)提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；兔抗巢蛋白(nestin)、兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光染料購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 NGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的效果觀察

1.2.1 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 取4只大鼠，脫臼處死，無(wú)菌條件下分離股骨，D-Hanks液沖洗多余血液，含1%的雙抗(青、鏈霉素)+10%FBS的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將所得細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5 %CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞細(xì)胞密度80 %～90%時(shí)，傳代。傳代至第5代，倒置顯微鏡下鑒定分離細(xì)胞。鏡下可見細(xì)胞密度均勻，以長(zhǎng)梭形為主，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs陽(yáng)性標(biāo)記物CD29、CD90表達(dá)率分別為99.8%、88.6%，CD34、CD45的表達(dá)率分別為1.8%、23.3%，證明分離細(xì)胞為BMSCs。

1.2.2 大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化 取傳代第5代的BMSCs，以4×105/mL細(xì)胞密度制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，將細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組兩組，觀察組加入3% DMSO、60 ng/mL NGF 、DMEM/F12預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)誘導(dǎo)2 h。和100 ng/mL NGF +DMEM/F12誘導(dǎo)液誘導(dǎo)49 h。對(duì)照組不加任何藥物，培養(yǎng)48 h后備用。

1.2.3 分化細(xì)胞鑒定 ①細(xì)胞形態(tài)觀察：采用倒置顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)。②神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)觀察組誘導(dǎo)完成第1、2、4 天和對(duì)照組任一時(shí)點(diǎn)NSE mRNA。根據(jù)GenBank公布的基因序列設(shè)計(jì)引物，由華大合成。NSE上游引物3′-TCGCCACATTGCTCAACT-5′，下游引物為3′-AACTCAGAGGCAGCCACATC-5′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。③NSE蛋白檢測(cè)：采用免疫細(xì)胞組化法檢測(cè)觀察組誘導(dǎo)完成第1、2天和對(duì)照組任一時(shí)點(diǎn)NSE蛋白。著色的為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取3張玻片觀察，每張玻片選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以5個(gè)視野的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)代表各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 NGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 采用生物信息學(xué)軟件STRING10.0[10]對(duì)NGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，選取交互作用評(píng)分大于0.9的互作關(guān)系構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。用生物圖表可視化工具Cytoscape3.4.0軟件[11]對(duì)各節(jié)點(diǎn)的度和中心度進(jìn)行計(jì)算，篩選該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(diǎn)(中心度>0.05，度高于均值)。用 Cytoscape 3.4.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為minimum size=6, minimum density=0.05，P<0.05。 用DAVID軟件[12]對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化的細(xì)胞鑒定結(jié)果 鏡下可見觀察組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核固縮，核質(zhì)比降低，細(xì)長(zhǎng)突起明顯，部分細(xì)胞間以網(wǎng)絡(luò)狀連接。誘導(dǎo)完成第1、2、4 天，與對(duì)照組比較，觀察組NSEmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.34±0.06、2.23±0.23、1.56±0.09，P均<0.05。觀察組誘導(dǎo)完成第1、2 天NSE蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(35±8)、(133±6)個(gè)，對(duì)照組未檢測(cè)到NSE蛋白，兩組比較，P均<0.05。

2.2NGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的蛋白網(wǎng)絡(luò) 以NGF為種子節(jié)點(diǎn)，利用STRING10.0 數(shù)據(jù)庫(kù)分析與NGF直接發(fā)生作用的蛋白節(jié)點(diǎn)，共得到105個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)。用Cytoscape3.4.0可視化軟件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度和中心度后得到3個(gè)中心節(jié)點(diǎn)，分別為NGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)和泛素C(UBC)。NGF與Ras蛋白特定鳥嘌呤核苷酸釋放因子1(RASGRF1)、 腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、 生長(zhǎng)抑制蛋白(NDN)、NGF、NGFR、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(NTRK1)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶2(NTRK2)、 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NTF3)、 極微小蛋白激酶C(PRKCI)、GTP結(jié)合蛋白R(shí)AC、核糖體蛋白S27A(RPS27A)、 信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)、 酪氨酸羥化酶(TH)、 泛素A52(UBA52)、泛素B(UBB)和UBC等蛋白相互作用調(diào)控神經(jīng)分化過(guò)程。NGF與RASGRF1、BDNF、NDN、NGF、NGFR、NTRK2、NTF3、PRKCI、RAC1、RPS27A、TH、UBA52、UBB、UBC共同調(diào)控神經(jīng)發(fā)育，與BDNF、成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶(FURIN)、NTRK1、 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素6(PCSK6)、小G蛋白R(shí)HOA、原癌基因(HRAS)調(diào)控神經(jīng)元凋亡。模塊分析結(jié)果顯示中心節(jié)點(diǎn)NGF、NGFR和UBC在模塊1中發(fā)揮核心的作用。

3 討論

BMSCs的分化受基因和蛋白的影響，而這些基因或蛋白之間的相互作用在調(diào)控BMSCs分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在某種程度上可以說(shuō)，細(xì)胞分化是蛋白質(zhì)或基因在一定條件下相互作用的結(jié)果，若這些相互作用網(wǎng)絡(luò)被破壞或穩(wěn)定性丟失，會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的分化功能。因此本研究以NGF單因子誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化，同時(shí)應(yīng)用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析在神經(jīng)分化或其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與NGF共同作用的網(wǎng)絡(luò)因子。

本研究驗(yàn)證了NGF可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化，并穩(wěn)定表達(dá)NSE等標(biāo)志物，這與以往研究[5]結(jié)果一致。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息軟件分析，得到105個(gè)與NGF互作的蛋白因子，通過(guò)分析得知NGF、NGFR和UBC三個(gè)蛋白因子可能作為網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白發(fā)揮重要的作用。通過(guò)GO功能富集分析，篩選了與神經(jīng)分化、神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)凋亡相關(guān)的GO組。NGF與16個(gè)蛋白共同調(diào)控神經(jīng)分化，模塊功能分析將網(wǎng)絡(luò)中的蛋白聚集在兩大模塊，結(jié)果顯示中心節(jié)點(diǎn)NGF、NGFR和UBC在模塊1中發(fā)揮核心的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了核心蛋白的作用。而這些潛在的互作關(guān)系，或許是生物科學(xué)工作者要進(jìn)一步研究的方向。這對(duì)于解析細(xì)胞內(nèi)蛋白間相互作用關(guān)系以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制具有極其重要的意義。已有研究表明，NGF通過(guò)抑制損傷脊髓組織中興奮性氨基酸的釋放、周圍的炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)元細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流等一系列反應(yīng)抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[12～14]；RASGRF1的表達(dá)可以促進(jìn)NGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)[13]；與Ntrk1 和NGFR受體結(jié)合啟動(dòng)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控交感神經(jīng)和感官神經(jīng)發(fā)育中神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化及存活[14～16]；激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)，預(yù)防或延緩阿爾茨海默患者膽堿神經(jīng)元減少[17]。NTRK1是一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子高親和力受體，與NGF結(jié)合通過(guò)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化及收縮維持中樞及周圍神經(jīng)的發(fā)育和成熟，且發(fā)現(xiàn)該受體與NTF3結(jié)合支持軸突的延伸，卻不能維持神經(jīng)細(xì)胞的存活[18]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Ntrk1可編碼一種酪氨酸激酶受體TRKA蛋白，該受體與NGF作用，調(diào)控神經(jīng)元的存活、修復(fù)等活動(dòng)[19]。NGF和BDNF各自通過(guò)其特異受體發(fā)揮作用，在促使神經(jīng)元修復(fù)、軸突再生、調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)方面發(fā)揮了重要作用[9]。

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河北北方學(xué)院重大項(xiàng)目(120177)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項(xiàng)目(Z2015047)。

魏會(huì)平(E-mail: whp123456@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.010

R738.1

A

1002-266X(2016)39-0033-03

2015-11-10)