陳麗麗，唐小平，楊穎丞，萬沁，陳楓，丁春蘭，陳莊

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

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2型糖尿病患者Foxp3基因 rs3761548單核苷酸多態(tài)性觀察

陳麗麗，唐小平，楊穎丞，萬沁，陳楓，丁春蘭，陳莊

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目的 觀察2型糖尿病患者Foxp3 基因rs3761548單核苷酸多態(tài)性。方法 選取2型糖尿病患者216例(2型糖尿病組)、2型糖尿病前期患者207例(糖尿病前期組)、健康對照者216例(對照組)。抽取三組受檢者外周血，待血液凝固后離心，取下層血凝塊約300 μL，提取DNA。采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性法檢測基因型。統(tǒng)計各組基因型AA+AC的頻數和構成比。結果 經Hardy-Weinberg平衡檢驗，三組Foxp3基因rs3761548單核苷酸多態(tài)性符合遺傳平衡。2型糖尿病組基因型為AA+AC型構成比為43.5%(94/216)，明顯高于糖尿病前期組的34.3%(71/207)和對照組的32.4%(70/216)，P均<0.05，糖尿病前期組和對照組相比P均>0.05。結論 2型糖尿病患者存在Foxp3 基因 rs3761548單核苷酸多態(tài)性，基因型AA+AC構成比高。

叉頭框基因3基因；單核苷酸多態(tài)性；基因型；2型糖尿??；糖尿病前期

近年來研究發(fā)現免疫機制在2型糖尿病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[1,2]。CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞是維持機體免疫自穩(wěn)的重要T細胞功能亞群[3]。Foxp3 是X 染色體上基因編碼的叉頭樣轉錄因子家族成員，其主要表達于CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞，調控CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的發(fā)育及功能表達[4，5]。Foxp3 基因突變會導致CD4+CD25+調節(jié)性T細胞功能異常，進而影響糖代謝。2014年1月～2015年12月，我們觀察了2型糖尿病患者Foxp3 基因 rs3761548 單核苷酸多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取216例2型糖尿病患者(2型糖尿病組)，其中男90例、女126例，年齡(63.6±8.9)歲；207例2型糖尿病前期患者(糖尿病前期組)，其中男67例、女140例，年齡(61.3±9.5)歲；216例健康對照者(對照組)，其中男90例、女126例。三組受檢者均來自無親緣關系的四川瀘州地區(qū)漢族人群。2型糖尿病及糖尿病前期依據1999年WHO糖尿病標準診斷。排除近期有感染、肝腎功能衰竭、惡性腫瘤、口服降脂藥物及有遺傳病家族史者。三組性別和年齡分布相比差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 Foxp3 基因 rs3761548 單核苷酸多態(tài)性檢測方法 抽取三組受檢者5 mL外周血，待血液凝固后，2 500 r/min離心5 min，取下層血凝塊約300 μL按照試劑盒(莊盟ZP314)說明書提取DNA。采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法檢測基因型。PCR反應體系共計12.5 μL，主要成分包括：40 ng 基因組 DNA, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL , 6.25 μL 2×Taq PCR MasterMix(0.1 U Taq Polymerase/μL, 500 μmol/L dNTP,20 mmol/L Tris-HCL,100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2), 余為雙蒸水。 PCR反應采用降落PCR反應程序。正向引物序列5′-CCCACAATCAAGGTTTTCG-3′，反向引物序列5′-CAGCGGCAGAGTTGAAATC-3′。PCR反應條件：預變性95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s, 68 ℃(每個循環(huán)遞降0.5 ℃) 30 s, 72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；95 ℃ 30 s, 45 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s共25個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。PCR擴增產物長度為359 bp，用1 U的限制性內切酶Pst Ⅰ于37 ℃將PCR產物酶切2 h，酶切產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，用Gel.Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad) 觀察酶切產物。并隨機選取部分PCR產物進行測序鑒定(上海生工生物科技公司)。Foxp3 基因 (rs3761548) 單核苷酸多態(tài)性位點如果為等位基因C則可以被酶切，如果為等位基因A則不能被酶切。所以酶切之后，基因型AA仍為1個片段(359 bp)，基因型AC為3個片段(359 bp、281 bp、78 bp)，基因型CC為2個片段(281 bp、78 bp)。DNA測序結果與酶切結果一致，AA基因型和CC基因型在單核苷酸多態(tài)性位點可見A堿基和C堿基單峰，AC基因型在單核苷酸多態(tài)性位點可見堿基A和堿基C疊加雙峰。統(tǒng)計各組基因型AA+AC的頻數和構成比。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件?；蛐头植枷冗M行Hardy-Weinberg平衡檢驗。組間基因型頻率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

經Hardy-Weinberg平衡檢驗，三組Foxp3基因rs3761548單核苷酸多態(tài)性符合遺傳平衡。2型糖尿病組基因型為AA+AC型構成比為43.5%(94/216)，明顯高于糖尿病前期組的34.3%(71/207)和對照組的32.4%(70/216)，P均<0.05；糖尿病前期組和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

Foxp3 是X 染色體上基因編碼的叉頭樣轉錄因子家族成員，人Foxp3 基因定位于染色體Xp11，cDNA 全長1 869 bp，編碼產物是一個約48 kD 的含431 個氨基酸的蛋白質。人類Foxp3 基因突變主要包括點突變、mRNA 剪切缺失及亮氨酸拉鏈區(qū)改變，這些改變可能進一步對調節(jié)性T細胞產生影響。文獻[6]報道，利用siRNA介導的基因沉默技術阻斷調節(jié)性T細胞中Foxp3 基因的表達，調節(jié)性T細胞免疫調節(jié)功能降低， 細胞表面分子如CD25、CD45RB、CTLA-4 及GITR 等下調。Fontenot等[7，8]發(fā)現Foxp3 突變鼠和Foxp3 缺失鼠體內CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數目減少。何云鋒等[9]研究發(fā)現將，Foxp3表達載體轉染至調節(jié)性T細胞可增強調節(jié)性T細胞分泌IL-10和TGF-β功能。

本研究結果顯示，2型糖尿病組AA+AC基因型構成比明顯高于對照組，提示Foxp3 基因 rs3761548 單核苷酸多態(tài)性可能與2型糖尿病的發(fā)生有一定關系。雖然目前對于這種關系的具體機制尚不清楚，但是近年來的研究表明，CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞與胰島素抵抗和代謝綜合征有關。Feuerer 等[10]研究發(fā)現CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞的數量在肥胖小鼠腹部脂肪組織中增加，在存在胰島素抵抗的肥胖小鼠腹部脂肪組織中減少。另有文獻報道，代謝綜合征患兒外周血CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞數量低于健康對照組，并且其數量隨著代謝紊亂的惡化進一步減少[11]，而且代謝綜合征患兒CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞存在功能異常[12]。CD4+Foxp3+調節(jié)性T細胞在胰島素抵抗和代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，Foxp3是調節(jié)性T細胞發(fā)育和產生功能的關鍵因素[13]。

由于Foxp3基因對調節(jié)性的重要作用，近年來關于Foxp3基因與免疫性疾病關系的研究較多。研究表明，許多自身免疫性疾發(fā)病，如哮喘[14]、過敏性鼻炎[15]、類風濕關節(jié)炎[16]及系統(tǒng)性紅斑狼瘡[17]等患者Foxp3 基因表達明顯降低。目前己證實人類Foxp3 基因突變和單核昔酸多態(tài)性與多種自身免疫性疾病相關，而rs3761548 是Foxp3 基因啟動子區(qū)一員，是目前研究最為熱門的位點之一。文獻報道，rs3761548 AA 基因型攜帶者腎移植后獲得免疫排斥反應的概率明顯高于rs3761548 CC 型攜帶者[18]。吳再歸等[19]對不明原因流產的研究發(fā)現，攜帶rs3761548 A型等位基因的流產風險增加。另有研究表明[20]，rs3761548 AA型可能有更高的白癜風患病風險。本研究結果也表明，2型糖尿病患者rs3761548單核苷酸多態(tài)性AA+AC基因型構成比高于對照組，提示rs3761548單核苷酸多態(tài)性可能參與了2型糖尿病的發(fā)病機制。接下來的研究中我們將更加深入地研究rs3761548等位基因A對Foxp3基因表達的影響，以及這種影響對調節(jié)性T細胞的免疫調節(jié)功能有何影響，為闡明2型糖尿病以及相關的自身免疫性疾病的發(fā)病機制提供新的方向。

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中華醫(yī)學會臨床醫(yī)學科研專項資金-施貴寶內分泌糖尿病研究項目(12020160276)；四川省科學技術廳與瀘州市人民政府、瀘州醫(yī)學院聯合科研專項資金計劃項目(14JC01283-LH11)。

唐小平(E-mail： 253254624@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.026

R392.2

B

1002-266X(2016)39-0078-03

2016-06-25)