羅干，李廣，張超，孫天威

(1 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2 天津市人民醫(yī)院)

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骨質(zhì)疏松患者外周血Th17細(xì)胞比例變化及其與血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平的相關(guān)性

羅干1,2，李廣1,2，張超1,2，孫天威2

(1 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2 天津市人民醫(yī)院)

目的 觀察骨質(zhì)疏松(OP)患者外周血輔助性T細(xì)胞(Th)中輔助性T細(xì)胞17(Th17)比例變化，并分析其與血清白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)、白介素6(IL-6)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)水平的相關(guān)性。方法 選擇52例OP患者為觀察組，56例健康體檢者為對(duì)照組，抽取兩組空腹外周靜脈血，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算兩組外周血Th(CD4+T細(xì)胞)中Th17比例，采用ELISA法檢測(cè)兩組血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL。采用Spearman相關(guān)性分析法分析外周血Th17細(xì)胞比例與IL-17、IL-23、IL-6、RANKL的相關(guān)性。結(jié)果 觀察組、對(duì)照組外周血Th中Th17比例分別為2.77%±0.93%、1.32%±0.42%，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-17分別為(145.89±44.23)、(108.99±32.83)pg/mL ，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-23分別為(33.98±12.33)、(16.55±6.78)pg/mL，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-6分別為(84.98±45.98)、(23.98±9.88)pg/mL，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清RANKL分別為(0.16±0.05)、(0.12±0.04) μg/L，兩組比較，P<0.05。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，OP患者外周血Th中Th17比例與IL-17、IL-23、IL-6、RANKL均呈正相關(guān)(r分別為0.362、 0.347、0.122、0.875，P均<0.05)。結(jié)論 OP患者外周血Th中Th17比例升高，血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平升高。Th17可能通過(guò)升高IL-17、IL-23、IL-6、RANKL參與OP的骨代謝失衡過(guò)程。

骨質(zhì)疏松；輔助性T細(xì)胞；白細(xì)胞介素；核因子-κB受體活化因子配體

骨質(zhì)疏松(OP)是全身多系統(tǒng)骨骼疾病，主要表現(xiàn)為骨小梁減少、坍塌，骨密度降低，骨脆性增加等[1]。OP的發(fā)病機(jī)制主要與炎癥、免疫、遺傳等因素相關(guān)[2,3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)因主要分泌IL-17而得名，其與自身免疫性、炎癥性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[4]。IL-17、IL-23、IL-6、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)是Th17分泌的主要細(xì)胞因子，參與人體破骨作用。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于Th17在OP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的報(bào)道卻存在差異。本研究觀察了OP患者外周血Th17細(xì)胞比例變化，并分析其與血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平的相關(guān)性。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年12月～2016年3月天津市人民醫(yī)院骨科收治的OP患者52例，其中男20例、女32例，年齡45～75(60±12)歲，骨密度(BMD)為3.06±1.9 ,白細(xì)胞為(5.06±2.9)×109/L，AST為(32.53±23.64) g/L，ALT為(27.55±21.23) g/L，Hb為(145±16) g/L，Glu為(5.09±0.80) mmol/L，HDL-C為(1.45±0.36) mg/dL，LDL-C為(2.83±0.67) mg/dL ，載脂蛋白A1為 (1.35±0.16) g/L；均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會(huì)制定的原發(fā)性骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者，無(wú)其他并發(fā)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在除骨質(zhì)疏松外其他代謝疾病或影響骨代謝的疾病者；排除患有嚴(yán)重的慢性疾病者；排除惡性腫瘤患者；排除存在影響骨代謝藥物史者。另選擇56例同期天津市人民醫(yī)院門(mén)診就診的BMD正?；颊邽閷?duì)照組，其中男22例、女34例，年齡43～73(60±11)歲，BMD為 0.72±1.2。兩組年齡、性別比例等具有可比性。本研究經(jīng)天津市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 兩組外周血Th中Th17比例檢測(cè) 抽取兩組空腹外周血3 mL,抗凝，采用流式細(xì)胞儀和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血Th中Th17比例：取500 μL全血加入500 μL 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，加入刺激阻斷劑Cell Stimulation Cocktail 2 μL后充分混勻，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h。再次混勻取50 μL孵育后全血轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管中，加入胞外抗體CD3-PE 5 μL,4 ℃避光反應(yīng)20 min;加入300 μL破膜固定液避光反應(yīng)20 min;加入CD4-FITC 5 μL、藻紅蛋白Cy5- IL-17A 5 μL，4 ℃避光反應(yīng)20 min；洗滌后加入PBS 500 μL待測(cè)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用Flowjo7.6軟件計(jì)算Th17占總T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 兩組血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL檢測(cè) 抽取兩組空腹外周血3 mL,采用ELISA法檢測(cè)兩組血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL。所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。變量間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組、對(duì)照組外周血Th中Th17比例分別為2.77%±0.93%、1.32%±0.42%，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-17分別為(145.89±44.23)、(108.99±32.83)pg/mL，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-23分別為(33.98±12.33)、(16.55±6.78)pg/mL，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清IL-6分別為(84.98±45.98)、(23.98±9.88)pg/mL，兩組比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血清RANKL分別為(0.16±0.05)、(0.12±0.04)μg/L，兩組比較，P<0.05。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，OP患者外周血Th17細(xì)胞比例與IL-17、IL-23、IL-6、RANKL均呈正相關(guān)(r分別為0.362、 0.347、0.122、 0.875，P均<0.05)。

3 討論

Th17細(xì)胞因主要分泌IL-17而得名，是T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群。IL-17在小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中可促進(jìn)骨丟失[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中阻斷IL-17的作用可顯著的減少骨質(zhì)破壞[7]。這些結(jié)果表明，Th17細(xì)胞可能參與了OP的發(fā)病機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人群年齡每增加1歲骨量相應(yīng)下降1%，該現(xiàn)象在絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性尤其顯著，其每年骨丟失量甚至可以達(dá)到2%～5%，小梁骨丟失較皮質(zhì)骨丟失快，這一過(guò)程大概持續(xù)10～15年，此后的骨量丟失逐漸趨于平穩(wěn)[8]。Tyagi等[9]的研究顯示，雌激素缺乏可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，可能作為OP發(fā)病的一種新的機(jī)制。絕經(jīng)期女性往往雌激素迅速下降，可推測(cè)絕經(jīng)期女性的OP可能跟雌激素降低有關(guān)。普遍認(rèn)為，造成OP的主要因素是骨代謝失衡，骨代謝主要包括破骨細(xì)胞吸收舊骨質(zhì)同時(shí)由成骨細(xì)胞合成新骨加以代替的過(guò)程。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是骨代謝最小的功能單位，他們之間的平衡關(guān)系決定了OP與否，在生長(zhǎng)發(fā)育期新骨生成大于破骨的效應(yīng)，使得骨骼生長(zhǎng)；在骨峰值期的時(shí)候新骨生成等于破骨效應(yīng)，此時(shí)破骨效應(yīng)與新骨生成處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)；OP患者往往破骨效應(yīng)大于新骨生成，導(dǎo)致骨質(zhì)大量流失[10]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡關(guān)系在骨代謝相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用[11]。本研究結(jié)果顯示，觀察組Th中Th17比例及血清IL-17顯著高于對(duì)照組，與Molmar等[12]研究結(jié)果一致。有研究報(bào)道，在動(dòng)物模型中，TGF-β、IL-6、IL-23聯(lián)合誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化和成熟，IL-6對(duì)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3有重要作用，能促進(jìn)Th17分化和擴(kuò)增過(guò)程[13，14]。Annunziato等[15]研究認(rèn)為IL-23可以部分限制細(xì)胞融合和破骨細(xì)胞的存活。此外，在Th17細(xì)胞可以在RANKL和非分泌型巨噬細(xì)胞集落刺激因子的刺激下顯著增加破骨細(xì)胞的形成[6]。也有研究認(rèn)為T(mén)h17細(xì)胞不僅可以直接產(chǎn)生RANKL[16,17]，而且還可以刺激成骨細(xì)胞的分泌RANKL，同時(shí)在成骨細(xì)胞與骨髓細(xì)胞共同培養(yǎng)條件下能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化[18]。Schuarz等[19]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL-17即使在沒(méi)有RANKL存在的情況下，也可以直接刺激外周血單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，并促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟時(shí)出現(xiàn)的肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成。RANKL是破骨細(xì)胞吸收的終末效應(yīng)分子[20]。而Th17細(xì)胞可高表達(dá)RANKL，RANKL作用于破骨細(xì)胞前體誘導(dǎo)破骨[20]。本研究顯示，觀察組外周血Th中Th17比例顯著高于對(duì)照組，血清RANKL也顯著高于對(duì)照組，且外周血Th中Th17比例與血清RANKL表達(dá)水平呈正相關(guān)。該結(jié)果說(shuō)明Th17增加，誘導(dǎo)大量的RANKL生成，而RANKL可進(jìn)一步誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成增多，使得骨代謝平衡失衡，破骨效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成骨效應(yīng)，從而進(jìn)一步加重骨小梁破壞、骨量減少，最終導(dǎo)致OP。本研究還顯示，觀察組IL-17水平顯著高于對(duì)照組，且IL-17與外周血Th中Th17比例呈正相關(guān)。說(shuō)明IL-17也參與了破骨細(xì)胞的分化。血清IL-6、IL-23水平與外周血Th中Th17比例也呈正相關(guān)，說(shuō)明IL-23、IL-6、IL-17共同存在進(jìn)一步誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，使得IL-17大量產(chǎn)生，從而形成一個(gè)鏈?zhǔn)叫?yīng)，使破骨效應(yīng)持續(xù)，OP進(jìn)一步加重。

綜上所述，OP患者外周血Th中Th17比例升高，血清IL-17、IL-23、IL-6、RANKL水平升高。Th17可能通過(guò)升高IL-17、IL-23、IL-6、RANKL參與OP的骨代謝失衡過(guò)程。

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天津市衛(wèi)生局科技基金(2015KZ057)。

孫天威(E-mail: billsuntw@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.029

R681

B

1002-266X(2016)39-0085-03

2016-06-02)