劉瑞清, 梁　爽, 江　存, 徐祖順, 徐海波

(1. 湖北大學(xué)有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430062;

2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院放射科, 武漢 430030)

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溫度和pH敏感高分子含釓核磁共振成像造影劑的合成及性能

劉瑞清1, 梁爽2, 江存1, 徐祖順1, 徐海波2

(1. 湖北大學(xué)有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430062;

2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院放射科, 武漢 430030)

摘要以N-異丙基丙烯酰胺為溫度敏感單體, 以甲基丙烯酸為pH敏感單體, 與三丙烯酸菲洛啉釓進(jìn)行無皂乳液聚合, 一步合成了具有溫度和pH敏感的高分子含釓核磁共振成像(MRI)造影劑(TPRPP). 動態(tài)光散射測試結(jié)果表明, TPRPP的粒徑隨溫度或pH值的變化而發(fā)生較大的改變. 體外MRI測試結(jié)果表明, TPRPP的橫向弛豫時間(T1)的加權(quán)弛豫率約為11.3 L/(mmol·s), 為臨床造影劑Magnevist?的2.6倍. 體內(nèi)MRI結(jié)果表明, TPRPP在肝和脾中具有明顯的正增強效果. 研究結(jié)果表明, TPRPP是一種優(yōu)異的多功能MRI造影劑, 具有極大的臨床研究價值.

關(guān)鍵詞溫度和pH敏感高分子; 核磁共振成像; 無皂乳液聚合; 釓造影劑

徐海波, 男, 教授, 主要從事核磁共振成像研究. E-mail: xuhaibo1120@hotmail.com

近年來, 核磁共振成像(MRI)在臨床診斷中應(yīng)用廣泛, 尤其在癌癥和腫瘤的檢測上具有獨特的優(yōu)勢. 為了能更精確地分辨病變組織, 造影劑是不可或缺的. 目前, 低分子量的含釓配合物如Magne-vist?, Omniscan?和Dotarem?等由于具有低毒性和高穩(wěn)定性成為臨床僅有的一類MRI造影劑. 但此類造影劑具有體內(nèi)循環(huán)時間短、弛豫率低和用量大等缺點[1]. 功能高分子改性的含釓MRI造影劑不僅能有效地克服上述小分子造影劑的缺點, 同時還能賦予其特殊的功能, 如pH敏感性[2]、靶向性[3]和載藥性[4]等. 其中, 環(huán)境敏感高分子改性的含釓MRI造影劑由于在藥物的可控釋放中具有重要的應(yīng)用而受到廣泛關(guān)注. 由于病變組織具有較低的pH值和較高的溫度[5], 可作為有效的控制條件來調(diào)控藥物的釋放, 因而pH或溫度敏感高分子含釓MRI造影劑備受關(guān)注[2,6～9]. 目前, 合成pH或溫度敏感高分子含釓MRI造影劑的方法主要是先合成能與釓離子配位的高分子, 再與釓離子配位形成高分子含釓MRI造影劑[8,10～12]. 這類合成方法至少需要經(jīng)過兩步反應(yīng), 比較繁瑣; 此外, 直接配位在高分子上的釓離子容易脫離母體, 使合成的pH或溫度敏感高分子含釓MRI造影劑具有潛在的生物毒性[1,13,14]. 如果先將釓離子和不飽和單體反應(yīng)生成含釓的單體, 再與pH或溫度敏感單體共聚合, 既能減少合成步驟, 又可以使釓離子在聚合中固定在高分子網(wǎng)絡(luò)中, 對釓離子進(jìn)行多重固定, 減小了釓離子脫離高分子母體的機(jī)率. 由此可見, 開發(fā)一種簡單易行且能一步合成溫度和pH敏感的高分子含釓MRI造影劑的聚合方法具有重要意義和迫切需要.

本文以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為溫度敏感單體, 甲基丙烯酸(MAA)為pH敏感單體, 與三丙烯酸菲洛啉釓[Gd(AA)3phen·H2O]進(jìn)行無皂乳液聚合, 一步合成了具有溫度和pH敏感的含釓高分子MRI造影劑(TPRPP), 研究了TPRPP的pH和溫度敏感性、穩(wěn)定性、生物毒性及MRI造影性能, 結(jié)果表明, TPRPP可作為一種溫度和pH敏感的MRI造影劑. 本文的合成方法簡單易行, 便于實施, 簡化了傳統(tǒng)方法的合成步驟, 使釓在聚合過程中結(jié)合在高分子中, 有利于降低高分子的生物毒性; 在合成過程中以水作為介質(zhì), 具有低毒性和環(huán)境友好的特點.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

NIPAM(純度99%)和MAA(純度99%), 阿拉丁試劑公司; 苯乙烯(St)、過二硫酸鉀(KPS)、二甲亞砜、正己烷和甲苯均為分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; MAA和St采用減壓蒸餾后置于冰箱中, 備用; KPS和NIPAM分別在水和正己烷/甲苯(體積比, 1∶1)中重結(jié)晶后真空干燥備用.

美國Thermofisher公司Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀, 溴化鉀壓片; 美國FEI公司Tecnai G20型透射電子顯微鏡(TEM); 英國Malvern公司ZS90型動態(tài)光散射儀(DLS); 美國PE公司Optimal 8000型電感耦合等離子光譜發(fā)生儀(ICP); 美國Rayto 公司Rt2100c型酶標(biāo)儀; 德國Siemens公司Magnetom Trio型臨床掃描儀.

1.2溫度和pH敏感高分子含釓微粒的合成

參照文獻(xiàn)[15]方法合成Gd(AA)3phen·H2O. 采用無皂乳液聚合法一步合成TPRPP(反應(yīng)過程見Scheme 1). 將NIPAM(1.000 g), MAA(0.201 g), St(0.500 g)和KPS(0.150 g)分散于80 mL去離子水中, 于冰浴中超聲3 min后, 轉(zhuǎn)移至裝有回流冷凝管、聚四氟乙烯攪拌裝置、氮氣導(dǎo)管的250 mL四口燒瓶中, 充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆蚝笏〖訜嶂?0 ℃, 10 min后逐滴加入0.09 g Gd(AA)3phen·H2O的水溶液(15 mL). 滴加完畢后于80 ℃充分反應(yīng)3 h, 得到TPRPP.

按同樣的方法制備不添加Gd(AA)3phen·H2O量的樣品作為參照, 標(biāo)記為TPRPP1.

將TPRPP1和TPRPP分別裝入透析袋(截留分子量14000)中, 在去離子水中透析提純7 d, 每隔6 h換一次新鮮的去離子水. 將部分提純后的樣品于40 °C真空干燥48 h得到固體粉末樣品, 將純化后的乳液及干燥后的粉末樣品儲存?zhèn)溆?

1.3溫度和pH敏感性測試

將TPRPP乳液用去離子水稀釋后用DSL測試粒徑, 溫度每升高2 ℃記錄一次數(shù)據(jù). 為了檢測TPRPP的重復(fù)使用性, 檢測溫度在25和37 ℃之間交替變化時TPRPP粒徑的變化情況.

將TPRPP用不同pH值的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-buffer)稀釋后用DLS測試不同pH條件下TPRPP的粒徑. 同時測試pH值在2和7.4之間交替變化時TPRPP粒徑的變化情況.

1.4體外細(xì)胞毒性測試

采用典型的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測TPRPP的細(xì)胞毒性. 將HeLa細(xì)胞以1×104Cell/孔的濃度接種于含有細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中, 在37 ℃, 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的條件下培養(yǎng)24 h; 然后加入不同濃度的TPRPP繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 向每個孔板中加入5 μL 新鮮 MTT試劑(5 mg/mL), 于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h; 搖床振蕩后移除上清液, 并用磷酸鹽(PBS)緩沖液反復(fù)洗滌, 加入200 μL二甲亞砜后搖勻, 用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光值(OD). 相對細(xì)胞活性(Cell viability, %)用下式計算:

Cell viability(%)=(ODtreated/ODcontrol)×100%

式中, ODtreated為TPRPP培養(yǎng)后的吸光值; ODcontrol為培養(yǎng)液的吸光值.

1.5體外弛豫率測試

將TPRPP稀釋至釓離子濃度為0.025, 0.05, 0.1, 0.2和0.4 mmol/L后, 移至96孔板中, 置于臨床Siemens Magnetom Trio 3.0 T MR成像儀中掃描, 測得不同濃度的橫向弛豫時間(T1). 儀器參數(shù)為: 掃描視野10 cm×10 cm; 回波時間(TE): 9 ms; 矩陣大小: 128×128; 層厚為3 mm. 重復(fù)時間(TR)為300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500和2000 ms. 弛豫率(r1)由橫向弛豫時間T1的倒數(shù)對釓離子濃度進(jìn)行線性擬合得到.

1.6體內(nèi)MRI測試

將250 g的Sprague-Dawley大鼠用10%的三氯乙醚麻醉劑麻醉(40 mg/kg), 尾靜脈注射TPRPP(約0.05 mmol Gd/kg), 置于3.0 T Siemens Magnetom Trio上掃描. 分別收集0, 15, 30, 60, 120和360 min時T1加權(quán)圖像. 儀器參數(shù)TE/TR=10/0.44, 平均值6. 動物實驗在國家動物保護(hù)機(jī)構(gòu)和湖北大學(xué)動物使用委員會的允許下進(jìn)行.

2結(jié)果與討論

Fig.1　FTIR spectra of Gd(AA)3phen·H2O(a), TPRPP1(b) and TPRPP(c)

2.2TPRPP的形貌和尺寸分析

圖2為TPRPP1和TPRPP的TEM照片. 可以看出, TPRPP1和TPRPP呈單分散的球形結(jié)構(gòu), 粒徑約為200 nm. 在25 ℃時, DLS測得TPRPP1和TPRPP的平均水合粒徑(Dh)分別為 257.4和267.0 nm, 單分散指數(shù)(PDI)均小于0.1, 說明TPRPP1和TPRPP具有單分散性, 與TEM結(jié)果吻合. TEM測得的粒徑小于DLS測得的粒徑, 這是由于在TPRPP1和TPRPP中, 親水性高分子含量較大, 在水合體系中產(chǎn)生部分溶脹, 從而具有較大的尺寸.

Fig.2　TEM images of TPRPP1(A) and TPRPP(B)

Fig.3　Dh of TPRPP as function of temperature(A), pH(B), variation in Dh of TPRPP as 　alternate temperature of 25 and 37 ℃(C) and alternate pH value of 2.0 and 7.4(D)　The pH of (A) and (C) is 6.0; the temperature of (B) and (D) is 25 ℃.

2.3TPRPP的溫度和pH敏感性

用DLS測試溫度在25～43 ℃之間變化時TPRPP粒徑的變化. 由圖3(A)可知, TPRPP的Dh隨溫度的升高而減小,Dh從267.0 nm減小至218.8 nm, 共減小約50 nm. 這是因為, 溫度敏感性的本質(zhì)是高分子鏈間或鏈內(nèi)的氫鍵相互作用, 當(dāng)溫度高于TPRPP的低臨界轉(zhuǎn)變溫度(LSCT, 約為33 ℃)時, TPRPP內(nèi)部的氫鍵遭到破壞, 氫鍵的減小使其水溶性降低, 進(jìn)而TPRPP收縮,Dh減小[20].

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法簡稱LC-MS，是具有很高的分離能力和定性鑒別能力的技術(shù)，在檢測時能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜樣品的快速、高效分離。在LC-MS檢測苯并芘的研究方面，劉玉蘭等[21]用此方法對食用油中苯并芘的含量進(jìn)行檢測，定量時采用內(nèi)標(biāo)法對樣品的量進(jìn)行標(biāo)定，對樣品進(jìn)行分析得出苯并芘的檢測限為0.2～30μg/L，檢出限是0.1μg/L。該檢測方法主要適用于樣品的精確檢測，但是由于費時比較長，對檢測人員的要求比較高，當(dāng)需要對大批量的樣品進(jìn)行快速檢測時，此方法并不適用。

用DLS檢測TPRPP乳液在不同pH緩沖液(Tris-buffer)中的粒徑[圖3(B)], 當(dāng)pH從2增加到8時,Dh從260.1 nm增大至318.4 nm, 粒徑增大約60 nm. 這是因為, 在低pH值條件下, 強烈的氫鍵作用使高分子鏈結(jié)合相對緊密; 當(dāng)pH值高于PMAA的pKa值(約為6)[21,22]時, PMAA中的羧基離子化, 使得高分子鏈的親水性增強, TPRPP溶脹, 從而Dh變大[13].

為了進(jìn)一步研究TPRPP的重復(fù)使用性, 檢測了溫度和pH值反復(fù)變化時Dh的變化情況, 由圖3(C)可知, 當(dāng)溫度在25和37 ℃之間交替變化時,Dh呈交替變化規(guī)律. 當(dāng)溫度回到25 ℃時,Dh的最終變化也在可控的誤差范圍內(nèi). 當(dāng)pH值在2.0和7.4之間交替變化時,Dh的變化呈現(xiàn)與溫度交替變化類似的規(guī)律[圖3(D)]. 表明所得TPRPP同時具有較好的溫度和pH敏感性, 并具有較好的重復(fù)使用性. 在載藥和藥物的可控釋放中具有潛在的應(yīng)用價值.

2.4TPRPP的穩(wěn)定性

為了檢驗TPRPP在類似生物體環(huán)境中的穩(wěn)定性, 選擇接近腫瘤pH值(pH=4)和人體正常pH值(pH=7.4)作為實驗條件, 將10 mL TPRPP乳液在三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris-buffer, 0.01 mol/L, 50 mL)中透析(截留分子量: 14000)7 d, 檢測透析袋外緩沖液中釓離子的含量, 考察TPRPP在不同pH值條件下的穩(wěn)定性. ICP結(jié)果顯示, 透析袋外的緩沖液中, 釓離子的含量為0.003 mg/L, 可以忽略不計. 透析前后TPRPP乳液的Zeta電位均小于-30 mV, 且透析前后幾乎無變化. 結(jié)果說明釓離子在TPRPP中具有較強的結(jié)合力和穩(wěn)定性.

2.5TPRPP的細(xì)胞毒性

TPRPP體外毒性用MTT法進(jìn)行衡量. 由圖4可見, 當(dāng)TPRPP濃度大于2.0 g/L時, 相對細(xì)胞活性仍然高于95%, 表明所得TPRPP具有很低的毒性和較高的生物相容性.

Fig.4　Cell viability against Hela cells assessed by standard MTT assay

Fig.5　T1-weighted relaxivity of TPRPPThe longitudinal relaxation time(T1) is measured on a clinical 3.0 T MR scanner at various Gd(Ⅲ) concentrations.

2.6體內(nèi)和體外MRI成像

由圖5體外MRI成像結(jié)果可以看出, TPRPP具有明顯的MRI正增強效果,T1加權(quán)弛豫率(r1)為11.3 L/(mmol·s), 約為臨床造影劑Magnevist?[約4.3 L/(mmol·s)]的2.6倍. 高弛豫率主要歸功于TPRPP中含有親水的PMAA和PNIPAM, 由Solomon-Bloembergen-Morgan理論可知, PMAA和PNIPAM能有效地提高造影劑的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間(τr)和水交換速率(τm), 有效地提高了TPRPP的弛豫率[23]. 此外, 在TPRPP中的高分子網(wǎng)絡(luò)中形成了釓離子的多網(wǎng)絡(luò)中心, 這對于獲得高弛豫率也做出了有效的貢獻(xiàn)[24]. 為了進(jìn)一步驗證TPRPP在體內(nèi)的增強效果, 采用尾靜脈注射法將TPRPP注射到老鼠體內(nèi), 在不同時間點對老鼠的肝和脾進(jìn)行MRI掃描. 圖6為不同時間點的MRI成像圖. 可以看出, 當(dāng)注入TPRPP 15 min后, MRI的圖像開始變白, 在3 h達(dá)到最亮, 6 h后仍然具有明顯的造影效果. 表明所得的TPRPP具有很好的MRI造影功能, 是一種潛在的MRI造影劑.

Fig.6　T1-weighted MR images taken at different time points　T1/min: (A) 0; (B) 15; (C) 30; (D) 60; (E) 120; (F) 360.

綜上所述, 通過無皂乳液聚合一步合成了具有溫度和pH敏感的含釓高分子MRI造影劑, 此方法簡單易行, 便于推廣, 為合成多功能MRI造影劑提供了新的選擇. 結(jié)果表明, TPRPP呈球形, 粒徑分布均一, 平均粒徑約200 nm. 無論是溫度或pH值變化,Dh均變化約60 nm, 表明TPRPP呈現(xiàn)較好的溫度和pH敏感性. 此外, TPRPP具有低細(xì)胞毒性、高穩(wěn)定性和較高的弛豫率, 為臨床造影劑Magne-vist?的2.6倍, 且具有優(yōu)異的體內(nèi)MRI造影成像功能. 可作為一種潛在的診療材料.

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Synthesis and Proporties of Temperature and pH-sensitive and Gadolinium

Contained Polymeric Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent?

LIU Ruiqing1, LIANG Shuang2, JIANG Cun1, XU Zushun1*, XU Haibo2*

(1.HubeiCollaborativeInnovationCenterforAdvancedOrganicChemicalMaterials;MinistryofEducationKey

LaboratoryfortheGreenPreparationandApplicationofFunctionalMaterials,HubeiUniversity,Wuhan430062,China;

2.DepartmentofRadiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityof

ScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

AbstractParamagnetic, temperature and pH-sensitive polymeric particles were prepared with N-isopropylacrylamide, methacrylic acid, styrene, and polymerizableGd(AA)3phen·H2O using emulsifier-free emulsion polymerization technique. Dynamic light scattering result shows that the diameter of the polymeric particles changes by about 60 nm as a result of variations in either the temperature or pH, indicating that the particles are pH and temperature-sensitive. TheT1-weighted relaxivity values at 3 T are about 11.3 L/(mmol·s) which is 2.6 times higher than clinical Magnevist?.InvivoMR imaging reveals that the TPRPPs can be effectively imaged in the liver and spleen, suggesting that they are excellent magnetic resonance imaging agents.

KeywordsTemperature and pH-sensitive polymer; Magnetic resonance imaging(MRI); Emulsifier-free emulsion polymerization; Gadolinium contrast agent

(Ed.: W, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.51273058, 81171386, 81372369).

doi:10.7503/cjcu20150570

基金項目：國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 51273058, 81171386, 81372369)資助.

收稿日期:2015-08-20. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-20.

中圖分類號O633

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡介:徐祖順, 男, 教授, 主要從事功能高分子研究. E-mail: zushunxu@hubu.edu.cn