厲新妍 方 亮 黃淑琳

(1廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2香港大學(xué)理學(xué)院，中國(guó) 香港)

·論著·

特異長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和驗(yàn)證

厲新妍1*方 亮1黃淑琳2

(1廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2香港大學(xué)理學(xué)院，中國(guó) 香港)

目的:分析肝細(xì)胞癌組織與配對(duì)癌旁組織中表達(dá)差異的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA),探討可能與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的特異lncRNA。 方法：采用lncRNA芯片技術(shù)，檢測(cè)5例肝細(xì)胞癌和其配對(duì)癌旁正常組織中的lncRNA和mRNA，篩選出差異表達(dá)的lncRNA和mRNA。運(yùn)用分層聚類分析，GO分析和pathway分析等生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分類。最后從中選擇10個(gè)lncRNA用RT-PCR進(jìn)行定量驗(yàn)證。 結(jié)果：有1 359個(gè)lncRNA表達(dá)水平出現(xiàn)顯著性差異，差異倍數(shù)>2倍。629個(gè)顯著上調(diào)，占46.2%，其中125個(gè)表達(dá)5倍以上；730個(gè)顯著下調(diào)，占53.7%，其中110個(gè)表達(dá)5倍以上。聚類分析結(jié)果：① 基因間 lncRNA有11 706條，其中與已知編碼基因相距<300 kb的lncRNA共有352條。② 增強(qiáng)子型 lncRNA 共有1 802條，其中與已知編碼基因相距<300 kb的lncRNA共有42條。③ HOX 基因簇共有101條。GO分析將mRNA分成分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分3類。Pathway分析結(jié)果：差異表達(dá)的mRNA基因所參與的細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)控通路共有61條，上調(diào)表達(dá)的mRNA參與12條通路，下調(diào)表達(dá)的mRNA參與49條通路。參與細(xì)胞周期和化學(xué)致癌作用的表達(dá)水平明顯改變。RT-PCR結(jié)果：8條lncRNA表達(dá)趨勢(shì)與基因芯片結(jié)果一致。對(duì)癌組和癌旁組進(jìn)行檢驗(yàn)，有6條有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：與癌旁組織比較，lncRNA肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯改變，可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

肝細(xì)胞癌；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；長(zhǎng)鏈非編碼RNA芯片

肝細(xì)胞癌目前在全世界惡性腫瘤中發(fā)病率排第4位，死亡率第2位[1]。其具有侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移發(fā)生率高的特點(diǎn)，病死率高、預(yù)后差，5年生存率低于10%[2]。研究肝癌的發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制非常重要，早期發(fā)現(xiàn)肝癌，有利于提高肝癌的有效治療和整體預(yù)后。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄本大于200個(gè)核酸單位的非編碼RNA分子。lncRNA 與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。GWAS(genome-wide association study，全基因組關(guān)聯(lián)分析)證明， lncRNA 在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5]。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，許多異常表達(dá)的lncRNA在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[6]。近年來(lái)，運(yùn)用基因芯片技術(shù)， lnc RNAs 參與肝癌的發(fā)生機(jī)制的研究也有了很大進(jìn)展。本研究運(yùn)用lncRNA基因芯片，檢測(cè)肝細(xì)胞癌及配對(duì)癌旁組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜及特點(diǎn)，以期探索肝細(xì)胞癌新的早期診斷標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集2012年1月至2014年1月在廣州市第一人民醫(yī)院肝膽外科住院，確診為肝細(xì)胞癌行肝切除術(shù)治療的10例患者活組織標(biāo)本，其中肝細(xì)胞癌組織5例、其配對(duì)癌旁組織5例，取標(biāo)本前均得到患者本人及家屬同意。癌旁組織均取自于腫瘤邊緣的2 cm外的相對(duì)正常組織并經(jīng)病理檢測(cè)確認(rèn)無(wú)腫瘤組織。患者中男 4例，女1例；年齡35～70歲，中位年齡54歲。腫瘤分化程度：高分化2例、中分化3例；術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為肝細(xì)胞癌(T1N0M0-T3N0M0)，術(shù)前沒(méi)有接受放療、化療、栓塞、射頻等治療；未合并其他良、惡性病變。

1.2 芯片選擇

所用基因芯片為Arraystar人類LncRNA芯片V3.0芯片。此芯片能夠檢測(cè)30 586個(gè)LncRNAs和26 109個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。

1.3 樣品總RNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè)

于5對(duì)肝細(xì)胞癌組織和其配對(duì)癌旁組織中，每一例分別取50～100 mg 液氮內(nèi)保存的肝細(xì)胞癌組織或癌旁組織，勻漿，再抽提 RNA。 使用Agilent Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在260、280、230 nm吸光度值，檢測(cè)RNA是否降解并測(cè)定RNA的濃度。RNA完整性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估。

1.4 RNA標(biāo)記和芯片雜交

從總RNA中移除rRNA后，得到mRNA(mRNA-ONLY(tm) Eukaryotic mRNA Isolation Kit，Epicentre)。使用隨機(jī)引物方法將每個(gè)樣品放大并轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)純化標(biāo)記的cRNAs，并用NanoDrop ND-1 000檢測(cè)濃度和活性。芯片雜交。洗滌、固定并掃描雜交芯片[Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)]。

1.5 圖像采集

使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1) 獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用Gene Spring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過(guò)篩選高質(zhì)量探針(某探針在9個(gè)樣品中至少有1個(gè)被標(biāo)記為Present或Marginal)進(jìn)行進(jìn)一步分析。兩組樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)LncRNA或差異表達(dá)mRNA通過(guò)P-value/FDR篩選。兩個(gè)樣品間差異表達(dá)LncRNAs或差異表達(dá)mRNAs通過(guò)Fold Change篩選。

1.6 生物信息學(xué)分析

聚類分析：一般來(lái)說(shuō)，同一類樣品能通過(guò)聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇(cluster)中，聚在同一個(gè)簇的樣品可能具有相似的生物學(xué)性質(zhì)。利用聚類分析方法分析所有l(wèi)ncRNA，按照l(shuí)ncRNA表達(dá)水平將其分類。通過(guò)尋找定位并分析lncRNA鄰近的編碼基因，觀察 lncRNA的表達(dá)水平與其鄰近編碼基因mRNA表達(dá)水平是否相關(guān)，尋找lncRNA潛在的靶基因。

1.7 實(shí)時(shí)定量 PCR

從2倍以上差異表達(dá)的 LncRNA 中選取 10條在5例肝細(xì)胞癌組織及配對(duì)癌旁正常組織中進(jìn) RT-PCR驗(yàn)證。其中5條在肝癌組織中上調(diào)表達(dá)，5條在肝癌組織中下調(diào)表達(dá)。分別以序列名表達(dá)基因，簡(jiǎn)寫(xiě)為X1-X5代表上調(diào)表達(dá)基因，X6-X10代表下調(diào)表達(dá)基因。各基因及其引物如表1所示。

1.7.1 RT-PCR所用試劑2×PCR master mix(Arraystar，貨號(hào)：AS-MR-OO6-25)。引物設(shè)計(jì)軟件：Primer 5.0ViiA 7 Real-time PCR System (Applied Biosystems)。RNA抑制酶：Epicentre (貨號(hào)：SRI6310K)。 SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase: Invitrogen (貨號(hào)：18080-044)。5xRT緩沖液：Invitrogen(反轉(zhuǎn)錄酶自帶產(chǎn)品)。2.5MmdNTP 混合液：HYTest Ltd (貨號(hào)：7DN1)。Primer：由上?？党晒咎峁┬蛄?，英俊公司合成。

1.7.2 RT-PCR條件 95 ℃，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s)。每個(gè)樣品3管重復(fù),每次都將待測(cè)樣品及內(nèi)參同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(儀器自動(dòng)進(jìn)行-Ramp Rate為0.05 ℃/s)。

使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測(cè)基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測(cè)基因相對(duì)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 肝細(xì)胞癌和其配對(duì)癌旁組織基因芯片原始圖片

肝細(xì)胞癌和其配對(duì)癌旁組織基因芯片原始圖片見(jiàn)圖1～5。

2.2 肝細(xì)胞癌組和配對(duì)癌旁組織差異表達(dá)LncRNA的表達(dá)譜分析

通過(guò)表達(dá)譜芯片檢測(cè)，與癌旁組織比較，肝細(xì)胞癌組織中有1 359個(gè)LncRNA表達(dá)水平出現(xiàn)顯著性差異，差異倍數(shù)>2倍。629個(gè)顯著上調(diào)，占46.2%，其中125個(gè)表達(dá)5倍以上；730個(gè)顯著下調(diào)，占53.7%，其中110個(gè)表達(dá)5倍以上。見(jiàn)表2～4。

表1 各基因?qū)?yīng)引物序列表

圖1第一對(duì)；圖2第二對(duì)；圖3第三對(duì)；圖4第四對(duì)；圖5第五對(duì)

圖1-5 肝細(xì)胞癌和其配對(duì)癌旁組織基因芯片原始圖片

表2 差異表達(dá)lncRNA芯片結(jié)果(個(gè)，%)

2.3 火山圖及散點(diǎn)圖

火山圖中所有紅點(diǎn)代表肝細(xì)胞癌和癌旁組織中差異表達(dá)的LncRNA(P<0.05，fold change>2.0)。其后行RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的10個(gè)lncRNA(ENST00000412092、ENST00000550805、AA151944、ENST00000448255、ENST00000329536、ENST00000504368、ENST00000579251、TCONS_00016357、ENST00000508147、TCONS_00010747)均在圖中具體標(biāo)注，見(jiàn)圖6。

散點(diǎn)圖可直觀觀察差異表達(dá)的LncRNA在肝細(xì)胞癌組和癌旁組織組之間的相關(guān)性。X和Y軸的值都是標(biāo)準(zhǔn)化處理后的信號(hào)值。綠色線為折疊倍率線，折疊倍率≥2。差異表達(dá)的LncRNA分別在肝細(xì)胞癌組和癌旁組表達(dá)水平變量呈正相關(guān)，見(jiàn)圖7。

表3 肝細(xì)胞癌和癌旁組織上調(diào)表達(dá)差異5倍以上的部分lncRNA信息

表4 肝細(xì)胞癌和癌旁組織下調(diào)表達(dá)差異5倍以上的部分lncRNA信息

876543210-log10(pvalue)log2(FoldChange)CancervsPara-505ENST00000504368ENST00000579251TCONS_00016357ENST00000508147TCONS_00010747ENST00000329536AA151944ENST00000448255ENST00000550805ENST00000412092

圖6 肝細(xì)胞癌和癌旁組織中LncRNA變化火山圖

18161412108644681012141618CancerParaX-Axis[Para]X-Axis[Cancer]

圖7 肝細(xì)胞癌和癌旁組織中LncRNA變化的散點(diǎn)圖

2.4 聚類分析結(jié)果

采用聚類分析方法分析所有l(wèi)ncRNA，按照其特征性表達(dá)水平，可分成3類：基因間lncRNA(即LinclncRNA)，增強(qiáng)子型lncRNA(即Enhancer lncRNA)，HOX基因簇。通過(guò)定位并分析lncRNA鄰近的編碼基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)水平與其鄰近的mRNA表達(dá)有關(guān)。

①基因間lncRNA有 11 706條，其中與已知編碼基因相距<300 kb的lncRNA共有352條。② 增強(qiáng)子型lncRNA共有1 802條，其中與已知編碼基因相距<300 kb的lncRNA共有42條。③ HOX 基因簇共有101條。將聚類分析的結(jié)果用熱圖(Heat Map)表示，見(jiàn)圖8。

[4ca,Cancer][8ca,Cancer][6ca,Cancer][5ca,Cancer][9ca,Cancer][4para,Para][8para,Para][6para,Para][5para,Para][9para,Para]samplesgroups

注：縱列為樣本，橫行為lncRNA；紅色為上調(diào)表達(dá)lncRNA，綠色為下調(diào)表達(dá)lncRNA

圖8 差異表達(dá)lncRNA的聚類分析熱圖

2.5 基因本體論分析和生物學(xué)途徑分析

在5對(duì)樣本中可檢測(cè)到23 335 mRNA。通過(guò)對(duì)5對(duì)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與癌旁非腫瘤肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中有518個(gè)mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，954個(gè)mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(差異倍數(shù)>2，P<0.05)。對(duì)差異顯著表達(dá)的mRNA進(jìn)行了基因本體論(gene ontology ,GO)分析和生物學(xué)途徑分析(pathway analysis)。

2.5.1 GO分析 將mRNA從以下3類對(duì)mRNA進(jìn)行屬性歸屬和富集分析：生物學(xué)過(guò)程類(biological process，BP)、細(xì)胞組分類(cellular component,CC)、分子功能類(molecular function,MF)。表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的3類mRNA的構(gòu)成比見(jiàn)圖9，10。

2.5.2 生物學(xué)途徑分析 根據(jù)最新版本的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)肝細(xì)胞癌和癌旁組織中差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的mRNA進(jìn)行了生物學(xué)途徑分析。其中差異表達(dá)的mRNA基因所參與的細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)控通路，上調(diào)表達(dá)的mRNA參與12條通路，下調(diào)表達(dá)的mRNA參與49條通路。在上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞通路中，細(xì)胞周期信號(hào)通路富集度最高。在下調(diào)表達(dá)的細(xì)胞通路中，化學(xué)致癌作用富集度最高。見(jiàn)圖11。

2.6 對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

編號(hào)為X1-X10的lncRNA中，在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)。其中X1、X2、X3、X4在肝細(xì)胞癌組織中為上調(diào)表達(dá)；X6、X8、X9、X10在肝細(xì)胞癌組織中下調(diào)表達(dá)，與芯片結(jié)果一致。

肝細(xì)胞癌和癌旁組織比較，上調(diào)基因中X2、X3、X4差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)基因中X6、X9、X10差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

CellcyclephaseCellcycleprocessMphasemitoticcellcyclecellcycleMphaseofmitoticcellcyclemitosisnucleardivisionorganellefissionorganelleorganization10152025303505EnrichmentScore[-log10(Pvalue)]SlgGOtermsofDEgene-BP1015202505EnrichmentScore[-log10(Pvalue)]02468EnrichmentScore[-log10(Pvalue)]ABCchromosomechromosomalpartchromosomecentromericregionnucleuscondensedchromosomespindleintracellularnon-membrane-boundedorganellenon-membrane-boundedorganellecondensedchromosomekinetochorecondensedchromosomecentromericregionproteinbindingbindingDNAbindingnucleicacidbingdingpyrophosphataseactivitynucleoside-triphosphataseactivityhydrolaseactivity,actingonacidanhydrides…microtubulemotoractivityhydrolaseactivity,actingonacidanhydrideskinasebingdingSigGOtermsofDEgene-MFSlgGOtermsofDEgene-CC

注：A圖為BP、B圖為CC、C圖MF

注：A圖為BP、B圖為CC、C圖MF

圖11 表達(dá)上調(diào)(A)和下調(diào)(B)的mRNA富集度較高的10條信號(hào)通路

表5 肝細(xì)胞癌和癌旁組織中差異表達(dá)lncRNA的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果(n=5)

3 討 論

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，涉及多種基因和環(huán)境因素的協(xié)同作用，經(jīng)過(guò)多個(gè)病理及分子階段改變，實(shí)現(xiàn)由正常肝細(xì)胞演變?yōu)榘┘?xì)胞[7]。

lncRNA曾被稱為基因組中的"暗物質(zhì)"而未被重視[8-9]。但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，lncRNA某些特定區(qū)段在各種腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其與正常細(xì)胞的原癌基因有關(guān)，能抑制細(xì)胞凋亡。若其異常表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10-11]。多研究表明，lncRNA與肝細(xì)胞癌存在密切關(guān)系[12-14]。

本研究中，我們運(yùn)用美國(guó)Arraystar公司提供的lncRNA V3.0基因芯片，其可同時(shí)檢測(cè)mRNA的表達(dá)，并包含了當(dāng)今所有權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)的lncRNA，對(duì)肝細(xì)胞癌的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了深入全面的分析。選擇5對(duì)肝細(xì)胞癌和配對(duì)癌旁組織檢測(cè)其差異表達(dá)lncRNA，通過(guò)聚類分析，基因本體論和生物學(xué)途徑分析，對(duì)其中差異顯著表達(dá)的lncRNA和mRNA進(jìn)行分類，預(yù)測(cè)lncRNA的分子功能，最后利用qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)在肝細(xì)胞癌組織中，有629個(gè)lncRNA上調(diào)表達(dá)， 730個(gè)lncRNA下調(diào)表達(dá)。這些lncARNA中的絕大部分尚未深入研究，我們預(yù)測(cè)其可能參與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，為我們研究肝細(xì)胞癌提供了新的思路。

為了更好的分析差異顯著的LncRNA，我們運(yùn)用了多種生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。聚類分析可以獲得樣本間lncRNA和mRNA的表達(dá)模式的差異，根據(jù)基因芯片所測(cè)mRNA表達(dá)水平及變化，對(duì)鄰近的差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行分類，我們可以推測(cè)，LncRNA鄰近的編碼基因可能是其潛在的靶基因。GO分析顯示肝細(xì)胞癌組和癌旁組織對(duì)比有差異表達(dá)的mRNA與新陳代謝過(guò)程、細(xì)胞周期、染色體片段等方面相關(guān)。pathway顯示其中差異表達(dá)的mRNA基因所參與的細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)控通路，上調(diào)表達(dá)的mRNA參與12條通路，下調(diào)表達(dá)的mRNA參與49條通路。在上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞通路中，細(xì)胞周期信號(hào)通路富集度最高。在下調(diào)表達(dá)的細(xì)胞通路中，化學(xué)致癌作用富集度最高。說(shuō)明這條信號(hào)通路可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

為了驗(yàn)證芯片分析的結(jié)果，我們選擇了10個(gè)lncRNA通過(guò)RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與其在非腫瘤組織上的表達(dá)水平相比，ENST00000550805、AA151944、 ENST00000448255在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著升高；ENST00000504368、ENST00000508147、TCONS_00010747在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著降低。到目前為止對(duì)這6種lncRNA的功能特征及在人類疾病中的作用還非常缺乏了解。但是，基于其在肝細(xì)胞癌中的顯著高或低表達(dá)，它們極有可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生或發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)，其潛在價(jià)值值得未來(lái)進(jìn)一步研究去探討。

本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)，成功篩選并驗(yàn)證肝細(xì)胞癌和癌旁組織之間差異表達(dá)的lncRNA。進(jìn)一步通過(guò)與mRNA表達(dá)譜結(jié)合的聚類分析，基因本體論及生物學(xué)途徑分析，預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)的lncRNA與相關(guān)編碼蛋白基因間的功能聯(lián)系，為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供思路。

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(本文編輯:張輝)

Expression and verification of specific long non-coding RNA in hepatocellular carcinoma

LiXinyan1*,FangLiang1,HuangShulin2

(1GuangzhouFirstMunicipalPeople′sHospital,Guangzhou510180;2FacultyofScience,UniversityofHongKong,HongKong,China)

*Correspondingauthor:Email：lixinyan1005@126.com

Objective:To analyze the differentially expressed of long non-coding RNA (lncRNA) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and matched adjacent normal tissues,and to investigate the specific lncRNA that may be involved in the occurrence and development of HCC. Methods: lncRNA and mRNA were determined in 5 cases of HCC and the matched adjacent normal tissues using lncRNA chip technique,and the differentially expressed lncRNA and mRNA were screened out,and classified by bioinformatics techniques of hierarchical clustering analysis,GO analysis and pathway analysis. Finally,10 lncRNAs were selected for quantitative validation by RT-PCR. Results: There were significant differences in the expression levels of 1 359 lncRNAs,with a fold change > 2-fold. A total of 629 lncRNAs were significantly up-regulated,accounting for46.2%,of which 125 were more than 5-fold; 730 were down-regulated,accounting for 53.7%,110 of which were more than 5-fold. Cluster analysis: ① there were 11 706 lncRNAs between genes,among which 352 lncRNAs were<300 kb from the known coding genes. ② There were 1 802 enhancer-type lncRNAs,of which there were 42 lncRNAs with<300 kb distance from the known coding genes. ③ There were 101 HOX gene clusters. GO analysis divided the mRNA into molecular function,biological process and cellular component. Pathway analysis: There were 61 pathways in the differentially expressed mRNA genes involved regulation of cell life activity. Up-regulated mRNA was involved in 12 pathways,and down-regulated mRNA was involved in 49 pathways. The expression levels of the lncRNAs involved in the cell cycle and chemical carcinogenesis were significantly changed. RT-PCR: The expression trends of 8 lncRNAs were consistent with the gene chip. There were 6 significant differences between the HCC group and the matched adjacent normal group (P<0.05). Conclusion: The expression level of lncRNA in HCC is significantly changed compared with that in adjacent normal tissues,which may be related to the occurrence and development of HCC.

hepatocellular carcinoma; long non-coding RNA; long non-coding RNA chip

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.05.01

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B031800010)

*通訊作者：Email:lixinyan1005@126.com

R735.7

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2095-9664(2016)05-0001-08

2016-08-15)