陳千林，王振寶，宋迎春，劉夢(mèng)麗，許正茂，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；3.巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆庫爾勒 841000)

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新孢子蟲二溫式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

陳千林1，王振寶2，宋迎春3，劉夢(mèng)麗1，許正茂1，巴音查汗1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；3.巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆庫爾勒 841000)

摘要：根據(jù)新孢子蟲Nc2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化反應(yīng)中Taq DNA聚合酶、引物濃度和退火溫度等，建立新孢子蟲二溫式PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的片段大小(266 bp)相符，未擴(kuò)增出弓形蟲等蟲種的陽性DNA片段；擴(kuò)增片段經(jīng)克隆、測(cè)序發(fā)現(xiàn)與引物基因序列的同源性為100%；最低檢出量為32.5 fg/μL，是三步法PCR的10(-1)倍，但循環(huán)時(shí)間縮短了38 min；重復(fù)3次對(duì)10(-4)、10(-5)、10(-6)和10(-7)稀釋的陽性質(zhì)粒進(jìn)行二溫?cái)U(kuò)增，10(-7)稀釋均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。同時(shí)對(duì)156份牛全血DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為10.90%(17/156)，與《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)的檢出符合率為83.33%(30/36)，二者檢測(cè)結(jié)果差異性不顯著(P>0.05)。由此可見，建立的二溫式PCR檢測(cè)方法可用于臨床診斷和日常監(jiān)測(cè)新孢子蟲，為監(jiān)控“帶蟲宿主”提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：新孢子蟲；Nc2基因；二溫式PCR

新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)寄生于多種哺乳動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)的一種原蟲病。該病可導(dǎo)致妊娠母畜發(fā)生流產(chǎn)、死胎等，新生仔畜發(fā)生運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，牛對(duì)該病尤為敏感[1]。犬是新孢子蟲的終末宿主兼中間宿主，牛、羊、馬、豬等多種家畜均可作為其中間宿主。宿主通過吞食被孢子化卵囊或速殖子污染的水或飼草而發(fā)生水平感染；胎兒及仔畜可通過胎盤發(fā)生垂直感染[2]。感染后主要寄生于腦、脊髓、神經(jīng)和內(nèi)臟等組織中[3]。據(jù)報(bào)道，該病在牛類動(dòng)物中的感染率為10%～40%，最高可達(dá)82%[4-5]；我國新疆、青海、北京、吉林等地也有報(bào)道[6-7]。由其導(dǎo)致的繁殖障礙性疾病給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于目前還沒有可用于防治新孢子蟲病的有效疫苗和特效藥物，準(zhǔn)確的檢測(cè)、監(jiān)控技術(shù)是綜合防治該病的關(guān)鍵。

與三步法PCR檢測(cè)相比，二溫式PCR將退火、延伸合并成一個(gè)溫度，在提高退火溫度的同時(shí)增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性[8]。Nc2基因是新孢子蟲重要的表面抗原(SRS2)基因，被認(rèn)為是診斷犬新孢子蟲的特異性基因之一[9]。本試驗(yàn)在Nc2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，通過優(yōu)化各反應(yīng)條件，建立了一種特異、靈敏、快捷的二溫式PCR檢測(cè)方法。檢測(cè)結(jié)果與《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)的檢出符合率為83.33%(30/36)。本研究建立的二溫式PCR檢測(cè)方法可用于新孢子蟲病的臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)樣品血樣采集于巴州地區(qū)某4縣1市的156份牛全血；弓形蟲、牛環(huán)形泰勒、牛巴貝斯和牛雙芽巴貝斯等陽性DNA，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試驗(yàn)試劑DNeasy Blood/Tissue，德國QIAGEN公司產(chǎn)品；Premix ExTaq、DNA Marker DL 2 000、Plasmid Purification Kit等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，北京Trans公司產(chǎn)品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器ProFlexTMBase梯度PCR儀，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Qsep 100全自動(dòng)單通道毛細(xì)管電泳分析儀，中國臺(tái)灣Bioptic Inc公司產(chǎn)品；JY 1600C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；G: BOX EF(MOT)全自動(dòng)凝膠成像分析儀，英國SYNGENE公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1模板DNA制備嚴(yán)格按照QIAGEN DNA提取試劑盒提取血樣DNA，并使用NANO DROP 2 000測(cè)得DNA含量，置-20 ℃保存待檢。

1.2.2引物和PCR擴(kuò)增運(yùn)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.24軟件，根據(jù)GenBank中犬新孢子蟲Nc2基因序列(登錄號(hào)：JQ410454.1)保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增長度適用于二溫式PCR檢測(cè)的診斷引物Nc2 F和Nc2 R。Nc2 F序列為：5′-CAGGGTAATGCGGATCAGT-3′，Nc2 R序列為：5′ -GCTGGGTAGTGCTCGTC-3′；57℃退火，擴(kuò)增266 bp序列?！缎骆咦酉x病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)中引物NCF序列為：5′-GGGTGAACCGAGGGAAT-3′，NCR序列為：5′-TCGCCAGTCAACCTACG-3′；58 ℃退火，擴(kuò)增231 bp序列。委托北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。同時(shí)用2對(duì)引物共同對(duì)全血DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3陽性DNA克隆、測(cè)序回收、純化陽性產(chǎn)物連入pEASY-Blunt Zero Clong Vector，再轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp+/LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后運(yùn)用Plasmid Purification Kit提取菌體質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒和克隆菌送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.4優(yōu)化二溫法反應(yīng)體系及循環(huán)條件均勻設(shè)計(jì)法對(duì)25 μL反應(yīng)體系的TaqDNA聚合酶、引物濃度和退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化。TaqDNA聚合酶(5 U/μL)選擇0.08 μL～0.16 μL，以0.02 μL為一個(gè)梯度；引物(10 pmol/L)選擇0.5 μL～1.5 μL，以0.5 μL為一個(gè)梯度；退火溫度參照引物合成的建議溫度，擬設(shè)計(jì)退火-延伸溫度為56℃～72℃，以1℃為一個(gè)溫度梯度篩選最佳退火溫度。

1.2.5特異性試驗(yàn)應(yīng)用優(yōu)化的二溫反應(yīng)條件分別擴(kuò)增新孢子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯蟲和牛雙芽巴貝斯蟲陽性DNA，以評(píng)價(jià)其特異性。

1.2.6靈敏性試驗(yàn)對(duì)陽性質(zhì)粒(濃度為32.5 ng/μL)進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8，并對(duì)每個(gè)滴度模板進(jìn)行二溫PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其靈敏性。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)分別對(duì)滴度為10-4(3.25 pg/μL)、10-5(325 fg/μL)、10-6(32.5 fg/μL)和10-7(3.25 fg/μL)的稀釋質(zhì)粒重復(fù)進(jìn)行3次二溫?cái)U(kuò)增，以檢測(cè)其重復(fù)性。

1.2.8樣品檢測(cè)應(yīng)用建立的二溫式PCR檢測(cè)方法和《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)共同對(duì)156份牛全血DNA進(jìn)行檢測(cè)，比較2種方法檢出符合率，了解當(dāng)?shù)嘏Ｈ盒骆咦酉x病流行情況，并運(yùn)用SPASS軟件對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行差異性分析。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

2對(duì)引物三步法PCR反應(yīng)體系為25 μL：10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.1 μL，模板DNA 1 μL。Nc2 F/R循環(huán)溫度為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35次循環(huán)；72℃ 5 min。SN/T 3499—2013 NC F/R循環(huán)溫度為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30次循環(huán)；72℃ 10 min。取6 μL產(chǎn)物經(jīng)100 V電泳40 min，分別在266 bp和231 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，均與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～2.兩對(duì)引物的陽性檢測(cè)；3～4.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-2.Positive test of two pairs of primers；3-4.Negative control

圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR amplification results

2.2PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序結(jié)果

陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，獲得266 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期目的條帶相符。測(cè)序結(jié)果與引物所在基因序列(登錄號(hào)：JQ410454.1)的同源性為100 %(圖2)。

2.3二溫法反應(yīng)體系及循環(huán)條件的優(yōu)化結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化的25 μL二溫反應(yīng)體系為：10×PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物(10 pmol/L)1.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.16 μL，模板DNA 1 μL。循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 15 s，64℃退火-延伸30 s，30次循環(huán)；72℃5 min。總循環(huán)時(shí)間為43 min，較三步法節(jié)約38 min。取4 μL產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)泳道9擴(kuò)增條帶最亮，因此將64 ℃作為最佳退火-延伸溫度(圖3)。

2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

毛細(xì)管電泳儀選擇的DNA標(biāo)準(zhǔn)為0～1 000 bp，只有當(dāng)擴(kuò)增片段吸收峰高于Lower Marker激光頻射(RFU)方可判定為有效擴(kuò)增，且產(chǎn)物量與RFU值呈正相關(guān)。圖4中僅出現(xiàn)與目的片段大小相符的單一吸收峰，說明該引物的特異性非常好。同時(shí)對(duì)新孢子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯

蟲和牛雙芽巴貝斯蟲陽性DNA進(jìn)行二溫?cái)U(kuò)增，僅有新孢子蟲陽性DNA出現(xiàn)266 bp的擴(kuò)增條帶，可見二溫法的特異性較好(圖5)。

2.5靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

二溫法擴(kuò)增稀釋至10-7的陽性質(zhì)粒時(shí)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，即最低檢出量為32.5 fg/μL，有效檢出量是三步法的10-1倍，說明其靈敏性較好(圖6)。

圖2　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對(duì)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～17.退火-延伸溫度為56 ℃～72 ℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-17.The annealing-extension temperatures were 56 ℃-72 ℃

圖3篩選最佳退火-延伸溫度

Fig.3Screening optimal annealing-extension temperature

圖4　Nc2 F/R 引物二溫式PCR產(chǎn)物在266 bp處的特異性條帶

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.新孢子蟲陽性；2.弓形蟲陽性；3.牛環(huán)形泰勒蟲陽性；4.牛巴貝斯蟲陽性；5.牛雙芽巴貝斯蟲陽性；6.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.N.caninumpositive；2.T.gondiipositive；3.T.annulatapositive；4.B.bovispositive；5.B.bigeminapositive；6.Negative control

圖5特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.5Specificity test results

2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

二溫式PCR分別重復(fù)擴(kuò)增稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的陽性質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，10-4、10-5和10-6時(shí)呈漸暗的擴(kuò)增條帶，10-7無擴(kuò)增條帶，與原結(jié)果一致，說明該方法的重復(fù)性較好(圖7)。

2.7臨床檢測(cè)結(jié)果

2對(duì)引物共同對(duì)巴州部分地區(qū)牛全血DNA進(jìn)行檢測(cè)，二者同時(shí)檢出15份陽性樣品，檢出符合率為83.33%(30/36)(表1)。重復(fù)對(duì)差異性樣品進(jìn)行擴(kuò)增，仍未出現(xiàn)共同陽性樣品。兩檢測(cè)方法檢出結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，說明建立的二溫式PCR檢測(cè)方法具有較好的擴(kuò)增特性。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.三步法檢測(cè)；9～16.二溫法檢測(cè)；濃度分別為3.25 ng/μL、325 pg/μL、32.5 pg/μL、3.25 pg/μL、325 fg/μL、32.5 fg/μL、3.25 fg/μL、0.325 fg/μL

M.DNA Marker DL 2 000；1-8.The three-step detection；9-16.The two-temperature detection,the concentrations were 3.25 ng/μL,325 pg/μL,32.5 pg/μL,3.25 pg/μL,325 fg/μL,32.5 fg/μL,3.25 fg/μL,0.325 fg/μL,respectively

圖6靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.6The results of the sensitivity test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～12.對(duì)10-4(3.25 pg/μL)、10-5(325 fg/μL)、10-6(32.5 fg/μL)、10-7(3.25 fg/μL)稀釋的3次重復(fù)擴(kuò)增

M.DNA Marker DL 2 000;1-12.The amplification of 10-4(3.25 pg/μL),10-5(325 fg/μL),10-6(32.5 fg/μL),10-7(3.25 fg/μL) with 3 repeats

圖7重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.7The results of the repeatability test

3討論

新孢子蟲病作為多種家畜共患的繁殖障礙性寄生蟲病，給畜牧生產(chǎn)造成了巨大的損失。目前還沒有可用于防治的特效疫苗和有效藥物，準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法結(jié)合嚴(yán)格的隔離、淘汰措施對(duì)于該病的防控至關(guān)重要[10]。三步法PCR中退火溫度上升至延伸溫度約需4 s，在此程中即可合成長約240 bp～500 bp的片段。因此在擴(kuò)增100 bp～500 bp的片段序列時(shí)可直接省去延伸步驟而直接使用二溫式PCR方法，一般將退火-延伸溫度較三步法退火溫度提高5℃～10℃，以保證反應(yīng)的特異性[11]。

新孢子蟲Nc2和Nc5基因同被認(rèn)為是診斷犬新孢子蟲的特異性基因?！缎骆咦酉x病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)以Nc5基因設(shè)計(jì)引物，為與之相區(qū)別，本試驗(yàn)根據(jù)Nc2基因設(shè)計(jì)引物，成功擴(kuò)增出266 bp片段，與引物所在基因100%相似。經(jīng)靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，最終建立了新孢子蟲病二溫式PCR檢測(cè)方法。該方法最低檢出量為32.5 fg/μL，是三步法PCR的10-1倍，但反應(yīng)時(shí)間縮短了38 min。

同時(shí)應(yīng)用不同基因引物進(jìn)行檢測(cè)可有效地降低漏檢率。應(yīng)用二溫式PCR方法和《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)共同對(duì)156份牛全血DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為10.90%(17/156)和12.18%(19/156)，檢出符合率為83.33%(30/36)，與閆雙等[12]報(bào)道的新疆地區(qū)牛新孢子蟲陽性率為13.14%(212/1 613)相當(dāng)，高于史茜等[13]報(bào)道的新疆某4個(gè)規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)陽性率為6.49%(10/154)，其差異是由于閆雙等試驗(yàn)樣品和本試驗(yàn)采集樣品的范圍廣，更具地方代表性，史茜等結(jié)果更能具體代表當(dāng)?shù)啬撑?chǎng)的感染率。

由此可見，本研究建立的新孢子蟲二溫式PCR檢測(cè)方法特異、靈敏、快捷，可用于新孢子蟲病的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)控。

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Establishment and Application of Two-temperature PCR for DetectingNeosporacaninum

CHEN Qian-lin1，WANG Zhen-bao2，SONG Ying-chun3，LIU Meng-li1，XU Zheng-mao1，CHAHAN Ba-yin1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China；2.SynthesisTechniqueServiceCenterofYiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yining,Xinjiang,835000,China；3.AnimalDiseaseControlandDiagnosisCenterofBayinguolengMongoliaAutonomousPrefecture,Korla,Xinjiang,841000,China)

Abstract:According to the conserved sequence of Neospora caninum Nc2 gene,the specific primers were designed,the reaction conditions of Taq DNA polymerase,primer concentration and annealing temperature were optimized by using the uniform design method.The results showed that the amplified fragment was same with the expected length(266 bp);It can't amplify the positive DNA fragments of Toxoplasma gondii et.The cloning and sequencing results revealed that the sequence of the amplified fragment had 100% similarity to the target gene,and the minimum detection quantity was 32.5 fg/μL, which is 10(-1) times of three-step PCR method and the circulation time shortens about 38 minutes;There was no amplified band of 10(-7) diluted positive plasmids while 10(-4),10(-5),10(-6) and 10(-7)samples showed positive results after 3 repeats.156 bovine blood samples were detected and the positive rate was 10.90%(17/156) which had 83.33%(30/36) coincidence rate with "Technical specification of Neospora caninums quarantine"(SN/T 3499—2013).This study demonstrated that the two temperature PCR method could be used in clinical diagnosis and daily monitoring of Neospora caninum,and provide the technical support for monitoring reservoir host.

Key words:Neospora caninum；Nc2 gene；two-temperature PCR

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0030-05

中圖分類號(hào):S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：陳千林(1991-)，男，新疆庫爾勒人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)項(xiàng)目(201454129)；庫爾勒市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013051108)

收稿日期：2015-10-07