孫理云，劉志軍，周博文

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471003)

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洛陽不同養(yǎng)殖方式豬源大腸埃希菌耐藥性分析

孫理云，劉志軍，周博文

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471003)

摘要：為了解洛陽市散養(yǎng)和集約化養(yǎng)殖方式豬源大腸埃希菌耐藥譜， 采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定35株集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源大腸埃希菌(其中17株肥育豬源、10株生長(zhǎng)豬源、8株保育豬源)和6株散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/棒酸、頭孢噻肟、萘啶酸、恩諾沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素和大觀霉素共11種抗菌藥物的耐藥性。結(jié)果表明，散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌僅對(duì)氨芐西林、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素耐藥，集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源大腸埃希菌對(duì)11種檢測(cè)藥物的耐藥率明顯高于散養(yǎng)豬源的大腸埃希菌；測(cè)定41株細(xì)菌具有19種耐藥模式，其中散養(yǎng)肥育豬源大腸埃希菌有5種模式，集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源大腸埃希菌有17種模式， 13種為多重耐藥模式；88.6%(31/35)集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源菌交叉耐藥，33.3%(2/6)散養(yǎng)豬源菌僅交叉耐四環(huán)素和強(qiáng)力霉素。

關(guān)鍵詞：豬；大腸埃希菌；多重耐藥性

集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致食品動(dòng)物抗菌藥物的廣泛使用,造成動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不斷上升，也出現(xiàn)了很普遍的多重耐藥菌甚至泛耐藥菌。動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不僅會(huì)導(dǎo)致治療失敗，直接影響動(dòng)物的健康和福利[1]，也已成為公共衛(wèi)生的一種重要威脅，為全球普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，因而近年來人們加強(qiáng)了對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌的抗菌藥物抗性的監(jiān)測(cè)[1]。

監(jiān)測(cè)的細(xì)菌通常包括人獸共患病病原菌、獸醫(yī)病菌和指示菌[2]。監(jiān)測(cè)革蘭陽性菌耐藥性的指示菌常選腸球菌，革蘭陰性菌耐藥性的指示菌為大腸埃希菌。選這些細(xì)菌為指示菌是由于其作為人和動(dòng)物的主要共生菌無處不在，應(yīng)對(duì)抗生素選擇性壓力可獲得耐藥性，它們能將耐藥性轉(zhuǎn)移給致病菌及共生菌間轉(zhuǎn)移耐藥性[3]。

治療豬細(xì)菌性疾病常用的抗菌藥物包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、氟喹諾酮類和葉酸拮抗劑等，因而細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)常為對(duì)這些種類藥物耐藥性監(jiān)測(cè)，以期了解和掌握動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及擴(kuò)散程度，利于獸醫(yī)臨床合理選擇和使用抗菌藥物。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株2015年4月分離自河南省洛陽市某豬場(chǎng)健康豬糞樣,其中生產(chǎn)母豬大腸埃希菌菌株10株，分別為S1、S2、S3 、S5、S6、S7、S8、S9、S10和S11，育肥豬大腸埃希菌菌株17株，為Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18 和Y20，保育豬大腸埃希菌菌株8株，為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8。另有從2個(gè)散養(yǎng)戶養(yǎng)殖的健康育肥豬分離的大腸埃希菌菌株6株，分別為C1、C2、C3、C4、C5和C6。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2主要培養(yǎng)基和試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司的產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，北京雙螺旋微生物培養(yǎng)基制品有限公司產(chǎn)品。

抗菌藥物藥敏紙片5類11種，分別為β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林(Amp，10 μg/片，批號(hào)：150407)、阿莫西林/棒酸 (Amc，20 μg/10 μg /片，批號(hào)：150324)和頭孢噻肟(Ctx，30 μg/片，批號(hào)：150116)，氟喹諾酮類的萘啶酸(Na，30 μg/片，批號(hào)：150127)、恩諾沙星(Enr，15 μg/片，批號(hào)：150205)和氧氟沙星(Ofl，5 μg/片，批號(hào)：150123)，葉酸合成抑制劑類的復(fù)方新諾明(Sut，23.75 μg/ 1.25 μg/片，批號(hào)：150210)，四環(huán)素類的四環(huán)素(Tet，30 μg/片，批號(hào)：150206)和強(qiáng)力霉素(Dox，30 μg/片，批號(hào)：150324)，氨基糖苷類的慶大霉素(Gen，10 μg/片，批號(hào)：150104)和大觀霉素(Spt，100 μg/片，批號(hào)：150303)，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)采用臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行[4]。從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取3個(gè)～5個(gè)形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含5 mL適宜的肉湯培養(yǎng)基中。將肉湯培養(yǎng)物置37℃孵育12 h。將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板。涂布細(xì)菌后15 min之內(nèi)在瓊脂表面置放藥敏紙片。紙片貼好后15 min內(nèi)將平板倒置于37℃培養(yǎng)，16 h～18 h測(cè)定抑菌圈直徑，細(xì)菌耐藥性參照CLSI(2012)標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.2.2數(shù)據(jù)處理分析將對(duì)檢測(cè)某藥具抗性或中介的菌株歸為耐藥菌株；不同來源菌的耐藥率為耐藥菌株數(shù)與檢測(cè)菌株數(shù)之比。

大腸埃希菌抗菌藥物耐藥率，按照公式：A/Bxl00%來計(jì)算，A表示某種豬源大腸埃希菌耐藥菌的數(shù)量；B表示某種豬源大腸埃希菌所有菌株的數(shù)量。

計(jì)算不同來源菌的多重耐藥指數(shù):MARI=a/bc，其中a為代表某來源細(xì)菌的總抗菌藥物耐藥值，b代表檢測(cè)的抗菌藥物種類數(shù)目,c代表某來源細(xì)菌菌株數(shù),0

2結(jié)果

2.1多重耐藥指數(shù)

由表1可見，散養(yǎng)豬源菌的MARI最小，為0.12。集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源菌的MARI為0.57，其中母豬源菌最高，為0.64，保育豬源菌次之，為0.55，育肥豬源菌再次之，為0.53。

表1　不同生長(zhǎng)期豬源大腸埃希菌的多抗菌藥物耐藥指數(shù)

2.2耐藥率分析

不同生長(zhǎng)期的豬源大腸埃希菌對(duì)11種所測(cè)抗菌藥物的耐藥水平如表2所示。

表2　不同生長(zhǎng)期豬源大腸埃希菌的耐藥水平

散養(yǎng)育肥豬源菌僅對(duì)Tet有很高水平的耐藥性，對(duì)Amp和Dox 3種抗菌藥物有高水平的耐藥性，對(duì)其余8種抗菌藥物無耐藥性，均敏感。

集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源菌中，無論是保育豬源菌，育肥豬源菌還是母豬源菌，對(duì)Amp、Tet和Dox都具有極高的耐藥性，耐藥率80%～100%；此外，保育豬源菌和母豬源菌對(duì)Sut也有極高的耐藥性，育肥豬源菌對(duì)其有很高的耐藥性。對(duì)其余7種藥物，保育豬源菌，育肥豬源菌和母豬源菌的耐藥性不盡相同。保育豬源菌對(duì)Spt的耐藥水平極高，對(duì)Ctx、NA和Gen耐藥水平很高，耐藥率范圍37.5%～50%；對(duì)其余3種抗菌藥物耐藥率為0。育肥豬源菌對(duì)Ctx 、和NA耐藥性很高，對(duì)Enr、Ofl、Gen和Spt耐藥高性，耐藥率范圍23.5%～41.2%；對(duì)Amc無耐藥性，均敏感。母豬源菌對(duì)Ctx、NA、Gen和Spt有很高的耐藥性，耐藥水平60%～70%；對(duì)Enr、Ofl耐藥水平高，均為30%的耐藥率；對(duì)Amc也無耐藥性，均敏感。

2.3交叉耐藥分析

不同生長(zhǎng)期的豬源大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林、阿莫西林/棒酸和頭孢噻肟，氟喹諾酮類的萘啶酸、恩諾沙星和氧氟沙星，四環(huán)素類的四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，氨基糖苷類的慶大霉素和大觀霉素交叉耐藥結(jié)果見表3。

表3　不同生長(zhǎng)期豬源大腸埃希菌的交叉耐藥情況

集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源菌中，100%保育豬源菌交叉耐藥菌，交叉耐1類藥菌株最多，有B1、B2、B6、B7和B8五株；交叉耐3類藥菌株為B3、B4和B5。在8株保育豬源菌中，交叉耐Tet和Dox最為嚴(yán)重，100%菌株交叉耐Tet和Dox；交叉耐Amp和Ctx和交叉耐Gen和Spt菌株比率一樣，均為37.5%菌株，均為B3、B4和B5菌株。

17株育肥豬源菌82.4%交叉耐藥，其中交叉耐1類藥菌株最多,5株分別為Y6、Y9、Y10、Y15和Y16，交叉耐2類藥菌株有Y3、Y5、 Y17和Y20；交叉耐3類藥菌株有Y1和Y8；交叉耐四類藥菌株最少，為Y11、Y12 、Y13和Y20。育肥豬源菌中，52.9%交叉耐耐Tet和Dox，菌株數(shù)最多；交叉耐喹諾酮類的菌株次之，其中23.5%菌交叉耐NA、Enr和Ofl，5.9%菌交叉耐NA和Enr； 17.6%菌株交叉耐Amp和Ctx， 11.8%交叉耐Gen和Spt，相應(yīng)菌株見表3。

90%母豬源菌交叉耐藥，其中交叉耐1類藥菌株S5、S6，交叉耐2類藥菌株有S7、S8和S10共3株，交叉耐3類的有S1、S3和S7，交叉耐4類的有S2、S11。

10株母豬源菌中，80%交叉耐Tet和Dox，50%交叉耐Gen和Spt， 70%菌株交叉耐Amp和Ctx，30%菌株交叉耐NA、Enr和Ofl。

33.3%散養(yǎng)育肥豬源菌交叉耐Tet和Dox。

2.4耐藥譜及多重耐藥性分析

41株細(xì)菌共有19種不同的耐藥模式，從耐藥譜多樣性來看，母豬分離菌最大，10株菌有7種耐藥譜；17株育肥豬源菌有耐藥譜12種；保育豬分離菌耐藥譜多樣性最小，8株菌有4種耐藥譜(表3)。

10種耐藥模式有2株及以上的菌株，同一集約養(yǎng)殖場(chǎng)不同生長(zhǎng)階段的豬源大腸埃希菌有菌株具有同樣的模式，散養(yǎng)豬源大腸埃希菌和集約化養(yǎng)殖場(chǎng)的豬源大腸埃希菌菌株有些也具相同的模式(表4)。

按照Magiorakos A P等[6]的多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌定義，耐3類及以上的腸桿菌為多重耐藥菌，測(cè)定的41株細(xì)菌，散養(yǎng)豬源菌的耐藥模式均非多重耐藥模式，多重耐藥菌均屬集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源細(xì)菌，有13種耐藥模式，其中共有Amp-Tet-Sut模式，占集約化養(yǎng)殖場(chǎng)豬源菌82.9%(29/35)。共耐頭孢噻肟-恩諾沙星菌株有9株，母豬源菌3株、育肥豬源菌6株。

多重耐藥模式中以耐5類藥的占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，有8種模式,其中耐6種藥的模式有1種，耐7種藥的模式有3種，耐8種藥的模式有2種，耐9種藥的模式有1種，耐11種藥的模式有1種。

耐4類藥的菌株有4種模式，其中耐4種藥的模式有1種，耐5種藥的模式有1種，耐7種藥的模式有2種。

耐3類藥的菌株有1種模式。

集約化豬場(chǎng)分離菌優(yōu)勢(shì)耐藥模式為Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA-Enr-Ofl、Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA和Amp-Sut-Tet-Dox，菌株數(shù)均占檢測(cè)的集約化豬場(chǎng)分離菌數(shù)的14.3%(5/35)。

表4　不同生長(zhǎng)期豬源大腸埃希菌的耐藥模式

3討論

本試驗(yàn)所測(cè)菌株均分離自一豬一樣，一樣一株菌，避免菌株來自同一克隆，因而基本代表了調(diào)查豬場(chǎng)豬源大腸埃希菌基本狀況。

MARI是分析某部位指定菌群如大腸埃希菌耐藥性的極佳工具。菌株暴露于常用抗菌藥物，MARI>0.2,而少用或從不用抗菌藥物，MARI<0.2[7]?；贛ARI計(jì)算結(jié)果，散養(yǎng)育肥豬源菌的MARI<0.2，說明這些豬很少用或從沒用過抗菌藥物，這與我們?cè)儐栵曫B(yǎng)者的結(jié)果一致。集約化豬源菌的MARI為0.57，與Su H C等調(diào)查華南家畜糞腸桿菌的MARI值0.56結(jié)果相近[8]。

我們調(diào)查的散養(yǎng)小豬場(chǎng)，僅養(yǎng)殖育肥豬，實(shí)行“全進(jìn)全出”；喂養(yǎng)的飼料均為養(yǎng)殖戶自行加工，未添加任何藥物添加劑，加之所養(yǎng)豬不曾發(fā)病，未采用抗菌藥物治療，因而其大腸埃希菌不曾受到任何抗菌藥物壓力的選擇。分離的大腸埃希菌對(duì)臨床常用的5大類11種抗菌藥物的耐藥性只對(duì)使用歷史較久的抗菌藥物Amp、Tet和Dox有一定的耐藥性，而對(duì)其余8種藥物均100%敏感，這樣的結(jié)果也就不奇怪了。本試驗(yàn)中散養(yǎng)小豬場(chǎng)大腸埃希菌對(duì)Amp、Ctx、Gen的耐藥率與丹麥2009年、2013年屠宰場(chǎng)豬分離大腸埃希菌耐藥率結(jié)果相等或接近[9]，該國(guó)自1999年豬飼料中已禁用抗菌藥物作為促生長(zhǎng)劑。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，該集約化養(yǎng)殖豬場(chǎng)大腸埃希菌的耐藥性已相當(dāng)嚴(yán)重，對(duì)檢測(cè)的11種抗菌藥物多數(shù)具有較高甚至極高的耐藥性。每株細(xì)菌至少耐一種抗菌藥物，82.9%的菌株為多重耐藥菌?？偣矙z測(cè)了5類藥物，而5重耐藥菌株的比例達(dá)51.4%。

豬源大腸埃希菌對(duì)Amp、Tet、Dox和Sut的耐藥性極高，且較其他抗菌藥物都高；與國(guó)內(nèi)近些年絕大多數(shù)的調(diào)查類似，如河南、上海和山東豬源大腸埃希菌規(guī)?；i場(chǎng)大腸埃希菌對(duì)Amp、Tet和Sut具極高的耐藥性[10-13]，河南豬源大腸埃希菌對(duì)Dox耐藥率也極高[10-11]；歐盟、加拿大等國(guó)豬源大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)表明，其對(duì)Amp、Tet、磺胺類的耐藥性雖非極高，但也較其他抗菌藥物都高。其原因與這些抗菌藥物常用有關(guān)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)豬源大腸埃希菌耐藥性的調(diào)查報(bào)告較多，多為致仔豬黃痢、白痢或水腫的大腸埃希菌以及屠宰豬大腸埃希菌的耐藥性。對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬源菌耐藥性的調(diào)查不多見。目前國(guó)內(nèi)僅見有人對(duì)山東、上海和新疆不同生長(zhǎng)階段豬源大腸埃希菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行調(diào)查[12，14-15]。其結(jié)果與我們不盡一致，這應(yīng)與使用的抗菌藥物不同有關(guān)。

本調(diào)查的集約化豬源菌耐藥多樣性大，35株細(xì)菌有17種耐藥譜。從有限的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)母豬源菌和育肥豬源菌耐藥多樣性大于保育豬源菌，其原因如何，有待進(jìn)一步研究。

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Analysis of Antimicrobial Resistance ofEscherichiacoliIsolates from Different Farming Pigs in Luoyang

SUN Li-yun,LIU Zhi-jun,ZHOU Bo-wen

(CollegeofAnimalScience&Technology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471003,China)

Abstract:To investigate antimicrobial resistance profiles of Escherichia coli isolated from scattered pigs and intensive farming pigs,a total of 41 feacal samples were collected from pig farms in Luoyang.35 and 6 isolates,which were rspectively isolated from intensive farming pigs and scattered pigs,were identified as Escherichia coli.Antimicrobial susceptibility tests by the disk diffusion method were conducted for ampici-llin,amoxicillin-clavulanic acid,cefotaxime,nalidixic acid,enrofloxacin,ofloxacin,compound sulfamethoxazole,tetracycline,doxycycline,gentamicin and spectinomycin.The results revealed that the resistance of isolates from intensive pigs is higher than that from scattered pigs;41 isolates showed 19 drug resistance patterns.The isolates from scattered pigs have 5 no-multidrug resistant patterns,the isolates from intensive pigs have 4 no-multidrug resistant patterns and 13 multidrug resistant patterns;33.3% isolates from sca-ttered pigs are only cross-resistant to tetracyclines,54.3%(19/35)isolates from intensive pigs are cross-resistant to β-lactams,71.4%(25/35) to tetracyclines,28.6%(10/35) to aminoglycosides and 22.9%(8/35) to quinolones.

Key words:pig; Escherichia coli ; antimicrobial resistance

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0120-05

中圖分類號(hào):S859.796

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

作者簡(jiǎn)介：孫理云(1969-)， 男，河南封丘人，博士，副教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期：2015-09-21