姜園園，李溫明，劉　暢，曾范利，時(shí)　坤，李健明，刁乃超，李仲樂，劉東旭，杜　銳,5*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中華人民共和國(guó)鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧鐵嶺 112616；3.長(zhǎng)春市動(dòng)植物公園，吉林長(zhǎng)春 130022；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；5.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長(zhǎng)春 130118)

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抑制鹿源多藥耐藥結(jié)核菌中藥的篩選

姜園園1，李溫明2，劉暢3，曾范利4，時(shí)坤4，李健明4，刁乃超1，李仲樂1，劉東旭1，杜銳4,5*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中華人民共和國(guó)鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧鐵嶺 112616；3.長(zhǎng)春市動(dòng)植物公園，吉林長(zhǎng)春 130022；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；5.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長(zhǎng)春 130118)

摘要：為了篩選對(duì)鹿源多藥耐藥結(jié)核菌有效的中藥耐藥抑制劑，通過MABA法檢測(cè)24種中藥的水和乙醇提取物對(duì)多藥耐藥結(jié)核菌及標(biāo)準(zhǔn)菌p7Rv的體外抗菌效果，將篩選出的抗菌效果好的黃連醇提物和黃連水提物采用紫外分光光度法進(jìn)行活性成分含量測(cè)定，同時(shí)以MABA法與標(biāo)準(zhǔn)品比較體外抗結(jié)核菌活性。結(jié)果顯示,黃連、獨(dú)活和側(cè)柏葉有明顯的抗結(jié)核活性，其中黃連水粗提物和乙醇粗提物效果最佳，測(cè)得它們活性成分即總生物堿含量分別為22.74%和35.23%，并顯示二者與小檗堿的體外抗結(jié)核作用相同。

關(guān)鍵詞：鹿；多藥耐藥結(jié)核菌；中藥；耐藥抑制劑

鹿結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的鹿的慢性消耗性傳染病，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)鹿業(yè)的健康發(fā)展[1]。自從1978年在新西蘭的鹿場(chǎng)發(fā)現(xiàn)首例鹿結(jié)核病以來，鹿結(jié)核病相繼在世界范圍內(nèi)的鹿場(chǎng)被確診[2]。結(jié)核桿菌的宿主范圍廣，傳染人類的同時(shí)，在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。近年來隨著耐藥性結(jié)核菌株的增加，多藥耐藥結(jié)核病的防控已成為難題[4]。雖然過去幾十年來國(guó)際上針對(duì)結(jié)核病已開發(fā)出近20種藥物，但均存在毒副作用較大、易產(chǎn)生耐藥性、病人難以耐受等缺點(diǎn)。中藥是我國(guó)特有的豐富的自然資源，很多藥物在治療結(jié)核病方面有獨(dú)特的療效，而且不容易產(chǎn)生耐藥性。本研究選取有抑菌作用的24種中藥，分別獲得它們的乙醇提取物和水提取物，篩選對(duì)鹿源多藥耐藥結(jié)核菌有效的中藥耐藥抑制劑，從而為解決動(dòng)物源結(jié)核分支桿菌的耐藥性問題做出了有益的探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物及培養(yǎng)基異煙肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、鏈霉素(streptomycin,SM)、阿米卡星(amikaci,AM)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX) 、丙硫異煙胺(TH)、對(duì)氨基水楊酸(p-aminosalicylic acid,PAS)，均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所；INH、SM用滅菌蒸餾水溶解，其余藥物用DMSO溶解，充分溶解后以0.22 μm濾膜過濾，置-20℃保存?zhèn)溆?；荊芥、細(xì)辛、黃連、金銀花、連翹、紫花地丁、蒲公英、魚腥草、夏枯草、百部、白附子、蒼術(shù)、蘆薈、小茴香、遠(yuǎn)志、獨(dú)活、高良姜、側(cè)柏葉、艾葉、杜仲、蔥白、葎草、車前草、大蒜 24種中藥購自百草大藥房；二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司產(chǎn)品；Middlebrook7H9肉湯和MiddlebrookOADC增菌液，BD Difco 公司產(chǎn)品。

1.1.2試驗(yàn)菌株標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分支桿菌p7Rv、鹿源牛分支桿菌(MB-1)和結(jié)核分支桿菌(MT-7)，吉林大學(xué)于錄教授惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1耐藥性測(cè)定利用比例法[5]，參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]對(duì)牛分支桿菌(MB-1)和結(jié)核分支桿菌(MT-7)分別進(jìn)行INH(0.2 μg/mL)、RFP(40.0 μg/mL)、EMB(2.0 μg/mL)、SM(4.0 μg/mL)、AM(8.0 μg/mL)、OFX(2.0 μg/mL)、TH(40.0 μg/mL)、PAS (0.5 μg/mL)的耐藥性測(cè)定。置于37℃溫箱中培養(yǎng)，28 d后觀察培養(yǎng)結(jié)果。若(含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù))×100%大于1%，則認(rèn)為耐藥，反之為不耐藥。

1.2.2乙醇提取中藥稱取藥材粉末約20 g，用200 mL的900 mL/L的乙醇回流提取2次，之后再用750 mL/L的乙醇回流提取1次，每次約1 h，合并3次濾液，將濾液濃縮成浸膏。用DMSO溶解成20 mg/mL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3水提取中藥稱取藥材粉末40 g，用40 mL的水煎煮3次，每次約1.5 h，合并3次濾液，將其濃縮成干燥的浸膏。用DMSO溶解成20 mg/mL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4中藥對(duì)耐藥性結(jié)核分支桿菌的MIC測(cè)定中藥的MIC值的測(cè)定通過MABA顯色法[7-8]。標(biāo)準(zhǔn)菌p7Rv、耐藥性牛分支桿菌和耐藥性結(jié)核分支桿菌以無菌7H9肉湯培養(yǎng)基(Middlebrook7H9∶MiddlebrookOADC=9∶1)培養(yǎng)至McFarland1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?，并無菌稀釋20倍。分別以無菌7H9肉湯培養(yǎng)基稀釋24種中藥的乙醇和水提取物稀釋至4倍最大期望最終檢測(cè)濃度。96孔細(xì)胞板四周加280 μL蒸餾水，其余孔加入100 μL無菌肉湯培養(yǎng)基，然后每行第1個(gè)孔加入100 μL中藥工作液，并對(duì)每行藥物進(jìn)行2倍系列稀釋，同時(shí)每板設(shè)有藥和無藥對(duì)照孔。將稀釋好的菌液加入所有檢測(cè)孔中以及無藥對(duì)照孔中, 每孔所含菌量約為8×105CFU/孔。同時(shí), 將菌懸液進(jìn)行1∶10和1∶100稀釋，代表工作菌量的10% 和1% 成長(zhǎng)。被檢測(cè)藥物的最終濃度從1 600 μg/mL 到6.25 μg/mL。在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的溫箱內(nèi)孵育，5 d后對(duì)照孔加入20 μL的0.15 g/L刃天青和12 μL的100 mL/L Tween 80，37℃孵育1 d。若對(duì)照孔變?yōu)榉奂t色，所有試驗(yàn)孔加入上述相同的刃天青和Tween 80混合溶液，37℃孵育24 h記錄結(jié)果。藍(lán)色孔為無細(xì)菌生長(zhǎng)，粉色孔為有細(xì)菌生長(zhǎng)孔。最低抑菌濃度(MIC)定義為阻止顏色變化的最低藥物濃度。每種藥物重復(fù)2次。

1.2.5黃連總生物堿的含量測(cè)定通過核酸染料法[9-10]測(cè)定黃連總生物堿的含量。

1.2.5.1對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的制備稱取適量的鹽酸小檗堿，用pp.6檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容后的濃度為92.0 μg/mL。

1.2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，加入pp.6檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液至4 mL，再加入3 mL溴甲酚綠和10 mL的氯仿，劇烈震搖3 min，靜置20 min取氯仿液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，無對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的氯仿液做空白對(duì)照。取小檗堿1 mL，按上述方法制備氯仿液，在300 nm～700 nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果在417 nm有最大吸收值。

1.2.5.3樣品含量的測(cè)定將黃連水提物和醇提物的浸膏溶解成100 μg/mL，各取0.5 mL，按與標(biāo)準(zhǔn)品相同的方法制備氯仿液，根據(jù)小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品總生物堿的含量。

1.2.6黃連總生物堿與標(biāo)準(zhǔn)品(小檗堿)體外抗結(jié)核菌活性測(cè)定，測(cè)定黃連總生物堿與標(biāo)準(zhǔn)品MIC方法同1.2.4。黃連總生物堿的濃度和小檗堿的濃度均從400 μg/mL 到1.06 μg/mL。

2結(jié)果

2.1耐藥性測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)鹿源牛分支桿菌MB-1對(duì)一線藥物INH、REP和SM表現(xiàn)為耐藥，對(duì)二線藥物PAS、AM和OFL表現(xiàn)為耐藥；結(jié)核分支桿菌MT-7對(duì)一線藥物INH、REP和SM表現(xiàn)為耐藥，對(duì)二線藥物PAS和OFL表現(xiàn)為耐藥，證明2株鹿源結(jié)核菌均為多藥耐藥結(jié)核分支桿菌(表1)。

表1　MB-1和MT-7對(duì)8種藥物耐藥性檢測(cè)結(jié)果

注：S.敏感；R.耐藥。

Note: S.Sensitive；R.Resistance.

2.2中藥對(duì)耐藥性結(jié)核桿菌的MIC測(cè)定

從24種中藥的水提物、醇提物中篩選出抗p7Rv、MB-1、MT-7效果明顯的有4種，即黃連水提物、黃連醇提物、獨(dú)活醇提物、側(cè)柏葉醇提物。測(cè)得黃連水提物的MIC值均小于200，黃連醇提物的MIC值均小于100，獨(dú)活醇提物的MIC值均在400，側(cè)柏葉醇提物的MIC值均為400(表2)。其余中藥提取物抗p7Rv、MB-1、MT-7的效果不明顯，其MIC值均大于800。

2.3黃連總生物堿的含量測(cè)定

經(jīng)光譜掃描，在417 nm有最大吸收值(圖1)，以鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)吸光光度值為縱坐標(biāo)得到的回歸方程為y=0.042x+0.113, r=0.999 4(n=6) (圖2)，結(jié)果表明,鹽酸小檗堿在3.68 μg/mL～22.8 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。黃連水提物的總堿含量為22.74%，黃連醇提物的總堿含量為35.25%。

表2　部分中藥提取物對(duì)p7Rv、MB-1和MT-7的MIC檢測(cè)結(jié)果

圖1　波長(zhǎng)掃描圖

圖2　小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4黃連總生物堿與標(biāo)準(zhǔn)品(小檗堿)體外抗結(jié)核菌效果

黃連水提物、醇提物與小檗堿抗p7Rv、MB-1、MT-7 的MIC值均小于200，且黃連醇提物與小檗堿的MIC值相同，兩者的MIC值均低于黃連水提物的MIC值，體外抗菌效果較好(表3和圖3)。

表3　p7Rv、MB-1和MT-7的黃連水提物、

1、2.黃連水提物;3、4.小檗堿;5、6.黃連醇提物

1,2.Aqueous extracts fromCoptidisrhizome;3,4.Berberine;5,6.Ethanol extracts fromCoptidisrhizome

圖3黃連水提物、醇提物與小檗堿抗結(jié)核菌對(duì)比

Fig.3The experimental results by comparison of aqueous and ethanol

extracts fromCoptidisrhizomeand berberine antitubercular activity

3討論

養(yǎng)鹿業(yè)是吉林省的特色產(chǎn)業(yè)，但由于抗結(jié)核化學(xué)藥物的廣泛應(yīng)用，人結(jié)核病的暴發(fā)流行以及耐藥性結(jié)核分支桿菌的不易治療，使得鹿結(jié)核病發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重阻礙了吉林省乃至我國(guó)養(yǎng)鹿業(yè)的健康發(fā)展。因此，尋找新的有效藥物治療結(jié)核病迫在眉睫。中藥在治療結(jié)核病方面具有西藥不可代替的優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)結(jié)核桿菌的耐藥性的方法有絕對(duì)濃度法[6]、比例法[5]及BACTEC460系統(tǒng)[10]等, 其中絕對(duì)濃度法是我國(guó)常用的檢測(cè)方法；比例法是WHO/IUATLD推薦在全球使用的結(jié)核菌耐藥監(jiān)測(cè)方法，此方法操作規(guī)范，結(jié)果準(zhǔn)確，容易進(jìn)行國(guó)際間的交流。國(guó)內(nèi)外還有采用微孔板[11]檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的MIC值，包括微量稀釋[12]MABA所需的培養(yǎng)基少，容易直觀觀察。本研究采用比例法來檢測(cè)結(jié)核桿菌的耐藥性，結(jié)果無論結(jié)核分支桿菌還是牛分支桿菌均對(duì)一線藥物的INH、RFP、SM產(chǎn)生耐藥性，對(duì)二線藥物的PSA、OFX均產(chǎn)生耐藥性，說明臨床分離出的結(jié)核桿菌多為多藥耐藥的結(jié)核分支桿菌。參照《中國(guó)藥典》選擇24種中藥，用單味草藥的提取物來觀察對(duì)耐藥性結(jié)核分支桿菌的生物學(xué)作用，結(jié)果表明，只有3種對(duì)多藥耐藥結(jié)核分支桿菌有明顯的抑制作用，其中以中藥黃連效果最為明顯。

黃連主要含有生物堿，以小檗堿(黃連素)為主，其次為黃連堿、掌葉防己堿(巴馬亭)、藥根堿、表小檗堿、甲基黃連堿、非洲防已堿、木蘭花堿等。因此本研究以小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，與黃連水提物和醇提物進(jìn)行比較。結(jié)果黃連醇提物對(duì)抗p7Rv、MB-1、MT-7的效果與小檗堿的效果相同，兩者均比黃連水提物的效果好。通過對(duì)黃連浸膏中總生物堿含量測(cè)定，結(jié)果顯示，黃連醇提物的總堿含量高于黃連水提物的總堿含量。并且獲得黃連醇提物的成本低，操作簡(jiǎn)便，不需要大量的儀器，該活性成分若能應(yīng)用于臨床或作為中藥藥物添加劑廣泛應(yīng)用，必將對(duì)解決動(dòng)物源結(jié)核菌耐藥性問題提供新的思路。

參考文獻(xiàn):

[1]杜銳. 中國(guó)養(yǎng)鹿與疾病防治[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：404.

[2]Griffin F T,Mackintosh C G.Tuberculosis in deer:perceptions,problems and progress[J].Vet J,2000,160(3):202-219.

[3]Zanella G,Bar-Hen A,Boschiroli M L,et al．Modelling transmission of Bovine tuberculosis in red deer and wild boar in Normandy, France[J].Zoonoses and Public Health,2012,59(2):170-178.

[4]World Health Organization.Global tuberculosis control and patient care:a ministerial meeting of high M /XDR-TB burden countries[R].Beijing：China,2009.

[5]WHO.Guide lines for surveillance of drug resistance in tuberculosis[R].WHO/TB,1994：178.

[6]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)．結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志，1996,18(1)：28-31.

[7]楊易燦.中藥光敏成分呋喃香豆精抗癌研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,1988,17(2):55-56.

[8]Franzblau S G,Witzig R S,Mclanfhlin J C,et al.Rapid,low technology.MIC determination with clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates by using the microplate Almamar Blue assay [J].J Clin Microbiol,1998,36(2):362-366.

[9]楊丹, 李軍, 解世全, 等.酸性染料比色法測(cè)定天仙子及其炮制品總生物堿含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊,2009,11(3):479-482.

[10]徐國(guó)良，熊友文，孫立波.酸性染料比色法測(cè)定黃連中總生物堿的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)報(bào),2010,22(4):32-34.

[11]Caldwell C G,FranzblauS G,Suarez E,et al.Oleanane triterpenes fromJunilliatridens[J].Nat Prod,2000,63:1611-1614.

[12]Caviedes L,Degodo J,GilmanR H.Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Clin Microbiol,2002,40(2):1873-1874.

Screening of Drug Resistance Inhibitors from Chinese Herbal Medicines for Multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisfrom Deer

JIANG Yuan-yuan1,LI Wen-ming2,LIU Chang3,ZENG Fan-li4,SHI Kun4,LI Jian-ming4,DIAO Nai-chao1,LI Zhong-le1,LIU Dong-xu1,DU rui4,5

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;2.LiaoningEntry-exitInspectionandQuarantineofthePeople'sRepublicofChina,Tieling,Liaoning,112616,China;3.ChangchunZoologicalandBotanicalPark,Changchun,Jilin,130022,China;4.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;5.KeyLaboratoryofAnimalProductionandtheProductQualityandSafety,MinistryofEducationJilinProvinceSikaDeerProductionandApplicationLab,Changchun,Jilin,130118,China)

Abstract:In order to screen drug resistance inhibitors from Chinese herbal medicines for deer multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis in vitro,24 kinds of Chinese herbal medicines extracted with water and ethanol were applied to detect sensitivity to multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis and p7Rv by MABA method.The aqueous and ethanol extracts of Coptidis rhizoma were testified to detect its active ingredient concentration by UV and compared with standard variety by MABA method.The date clearly demonstrated that Coptidis rhizoma，Angelicae pubescentis radix and Platycladi cacumen showed greater antimicrobial activity against drug-resistance Mycobacterium tuberculosis and p7Rv.Content of total alkaloid of aqueous and ethanol extracts were 22.74% and 35.23%,respectively.The antibacterial effects of extracts from Coptidis rhizoma were identical to berberine.

Key words:deer;multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis;Chinese herbal medicine;drug resistance inhibitor

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0054-04

中圖分類號(hào):S853.69

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：姜園園(1990-)，女，吉林四平人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372436)；吉林省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目(20140309018YY)；吉林省科技廳科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃項(xiàng)目(20130521023JH)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204028NY)

收稿日期：2015-09-24