李　強，王改玲，趙澤慧，何曉麗，許立華*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.黃淮學(xué)院生物工程系，河南駐馬店 463000)

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河南某湖羊場乳房炎的病原菌分離鑒定及防治

李強1，王改玲2，趙澤慧1，何曉麗1，許立華1*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.黃淮學(xué)院生物工程系，河南駐馬店 463000)

摘要：以某湖羊場發(fā)生的乳房炎病例為對象，通過細(xì)菌分離鑒定及生化試驗，并對所分離的菌株進(jìn)行藥物敏感試驗，確定主要致病菌及其耐藥特性，為該場湖羊乳房炎的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。試驗共分離得到30株細(xì)菌，其中葡萄球菌8株，占26.7%；大腸埃希菌22株，占73.3%。檢測結(jié)果顯示，葡萄球菌和大腸埃希菌是導(dǎo)致該場湖羊乳房炎的主要病原菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，這兩種病菌對氟苯尼考、頭孢噻呋鈉和多西環(huán)素高度敏感，而對阿莫西林、大觀霉素和培氟沙星等有耐藥性。在此基礎(chǔ)上，制定出針對該羊場湖羊乳房炎的相應(yīng)治療及預(yù)防措施。

關(guān)鍵詞：湖羊；乳房炎；細(xì)菌分離鑒定；藥敏試驗；防治

湖羊是太湖平原重要的家畜之一，是我國一級保護(hù)地方畜禽品種。近幾年來，隨著湖羊飼養(yǎng)方式由放牧向舍飼和半舍飼的過渡，湖羊的運動逐漸減少，加之羊場飼養(yǎng)管理不當(dāng)，導(dǎo)致湖羊乳房炎的發(fā)病率呈上升趨勢。乳房炎多發(fā)于泌乳期，臨床上有急性、慢性、隱性之分，急性病例以乳房的紅、腫、熱、痛為主要癥狀特點。若治療不當(dāng)或治療不及時，將直接影響泌乳量、乳品質(zhì)量及羔羊健康，甚至部分母羊產(chǎn)后無乳，影響羔羊的發(fā)育[1-4]。自2013年秋季以來，河南某湖羊養(yǎng)殖場在繁殖秋羔時節(jié)，部分母羊發(fā)生乳房炎，影響正常育羔。2013年11月初，該場的1 200只湖羊中，有60只泌乳羊發(fā)生乳房炎，產(chǎn)后3 d母羊精神沉郁，行走時后肢外跨，避開乳房，拒絕哺乳，觸摸反應(yīng)敏感并伴有體溫升高，食欲減退等癥狀。畜主及時用青霉素和鏈霉素肌肉注射3 d，病情不見好轉(zhuǎn)。及時采集病料，在黃淮學(xué)院動物微生物實驗室通過細(xì)菌分離及鑒定，藥敏試驗確定針對致病菌株的特異敏感藥物，并進(jìn)行針對性的治療，在此基礎(chǔ)上制定相應(yīng)的飼養(yǎng)管理和預(yù)防治療措施。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、綿羊血平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化鑒定管、藥敏紙片，中瑞合資上海諾華動物保健有限公司產(chǎn)品；其他無機(jī)試劑均為分析純試劑。

1.1.2主要儀器設(shè)備冰箱(BCD-252KU)，河南新飛電器有限公司；恒溫恒濕箱(HWS-250)，寧波江南儀器制造廠；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZM-40KCS)，上海申安醫(yī)療器械廠；無菌接種箱(WJ-J2X)，濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；雙目生物顯微鏡(Nikon 80i)，日本尼康公司；恒溫恒濕箱(HWS-250)，寧波江南儀器制造廠。

1.2方法

1.2.1乳樣采集采集乳樣30份，來自河南某湖羊場臨床型乳房炎。先對患病乳區(qū)進(jìn)行溫水清洗，后用750 mL/L酒精進(jìn)行消毒。配戴一次性無菌手套，棄掉前3把乳樣，置于30 mL無菌離心管中，用阿拉伯?dāng)?shù)字1～30編號，放入冰箱冷藏待檢。

1.2.2細(xì)菌分離與純培養(yǎng)從冰箱冷藏室取出待檢乳樣，置于無菌接種箱內(nèi)，搖勻后分別移取200 μL于伊紅美藍(lán)平板、綿羊血平板等培養(yǎng)基，迅速用無菌玻璃涂布棒在瓊脂表面均勻涂布。置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落生長情況及形態(tài)特征。挑取單個菌落進(jìn)行涂片，革蘭染色，鏡檢。根據(jù)培養(yǎng)特性和染色特性，挑取菌落置于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)物備用于生化試驗和藥敏實驗[5-6]。

1.2.3生化試驗將純培養(yǎng)物分別接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中，按照常規(guī)方法操作[7]，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)過18 h～24 h后觀察結(jié)果。通過判定生化反應(yīng)的結(jié)果，對分離所得菌株進(jìn)一步分類鑒定。

1.2.4藥物敏感性試驗采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法對分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥物的抑菌試驗，即用滅菌的一次性移液器頭吸取待測菌液約200 μL，分別滴在瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌的玻璃涂布棒將菌液涂布均勻，然后用無菌鑷子夾取藥敏紙片按一定距離均勻貼于其上。置37℃培養(yǎng)24 h，用卡尺測量抑菌圈直徑，最后取平均值記錄結(jié)果，判定抑菌效果[8]。供試藥物為氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、多西環(huán)素、阿莫西林、大觀霉素、培氟沙星、磺胺嘧啶鈉和硫酸慶大霉素。

2結(jié)果

2.1細(xì)菌分離結(jié)果

將采集的樣品分別接種不同培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后得到2種菌落，菌落Ⅰ有22株，在伊紅美藍(lán)平板上形成黑色，中等大小，邊緣較為光滑并泛有金屬光澤的菌落，革蘭染色陰性。顯微鏡觀察呈桿狀，兩端略微鈍圓，疑似大腸埃希菌；菌落Ⅱ 有8株，在綿羊血平板上菌落較大，不透明，能形成溶血環(huán)，革蘭染色呈陽性。通過顯微鏡觀察，細(xì)菌呈葡萄狀排列，疑似葡萄球菌。

2.2生化鑒定結(jié)果

結(jié)果見表1。

依據(jù)細(xì)菌的培養(yǎng)特征和顯微鏡觀察，以及這兩種菌落的生化鑒定結(jié)果，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)[9]確定：菌株Ⅰ為大腸埃希菌，檢出率為73.3%；菌株Ⅱ為葡萄球菌，檢出率為26.7%。

表1　生化試驗結(jié)果

注：“+”表示90%～100%菌株為陽性；“-”表示90%～100%菌株為陰性；“○+”表示產(chǎn)氣。

Note:"+" means 90%～100% positive isolates; "-" means 90%～100% negative isolates; "○+" means aerogenesis.

2.3藥敏試驗結(jié)果

選取臨床常用藥物，利用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗生素敏感試驗。抑菌圈直徑大于20 mm的為高敏，記為“++”；16 mm～20 mm的為中敏，記為“+”；小于16 mm的為耐藥，記為“-”(表2)。

由表2可知，大腸埃希菌和葡萄球菌對氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、多西環(huán)素高度敏感；個別菌株對阿莫西林、大觀霉素和培氟沙星等產(chǎn)生耐藥性。以上結(jié)果表明，當(dāng)前對該場湖羊乳房炎首選的治療藥物為氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、多西環(huán)素；另一方面，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株數(shù)量愈來愈多。因此對乳房炎的治療，須選用具有針對性的高度敏感藥物，才能取得較好的效果。

表2　藥敏試驗結(jié)果

2.4防治

2.4.1治療方案以往治療方案：發(fā)病當(dāng)天畜主立刻采取以往的治療方案，用青霉素和鏈霉素肌肉注射，1日1次，連用3 d，期間未采取其他治療措施，但病情持續(xù)惡化未見好轉(zhuǎn)。試驗治療方案：根據(jù)實驗室藥敏試驗檢測可知，氟苯尼考、頭孢噻呋鈉和多西環(huán)素為高度敏感藥物。對該場60頭患病湖羊先用生理鹽水沖洗乳房,然后用30%氟苯尼考與多西環(huán)素配伍，進(jìn)行乳房灌注，每1 kg體重20 mg～30 mg，1日1次，連用3 d～5 d，為1個療程。該療程后用頭孢噻呋鈉進(jìn)行肌肉注射，1日1次，連用3 d～5 d，為第2個療程。

2.4.2療效對比顯效：用藥后乳房炎癥消失，乳房內(nèi)無炎性分泌物和膿液排出，乳房功能恢復(fù)正常。

有效：用藥后乳房炎癥明顯緩解，乳房分泌物基本接近正常。

無效：用藥后乳房炎癥未見減輕，乳房分泌物未見好轉(zhuǎn)，甚至惡化，綜合判定和用藥前沒有變化。

治療結(jié)果見表3。

表3　試驗療效與以往療效對比

由表3顯示可知，經(jīng)過試驗方案治療，全程患病湖羊康復(fù)58頭，治愈率遠(yuǎn)高于以往方案。說明當(dāng)采用特定的敏感藥物進(jìn)行治療時，效果十分顯著，達(dá)到預(yù)期效果，為羊場挽回了損失。

2.5預(yù)防方案

2.5.1做好衛(wèi)生消毒工作保持羊舍干凈、衛(wèi)生，針對產(chǎn)房、哺乳舍，需要每日進(jìn)行全方位消毒。勤除積糞，勤換干土、墊料，防止羊臥在泥污和糞尿上通過乳導(dǎo)管感染乳區(qū)，造成乳房炎。

2.5.2加強飼養(yǎng)管理在產(chǎn)羔前1周內(nèi)，應(yīng)適當(dāng)減少精料和多汁飼料的投喂，加大優(yōu)質(zhì)干草的飼喂量，避免乳房因壓力增大，引發(fā)炎癥，造成腫脹。特別在分娩期間，由于乳汁大量分泌并長時間聚集，造成輸乳管淤滯結(jié)塊形成栓塞。因此，若畜主通過乳房撫摸到有感結(jié)塊，要及時對該部位進(jìn)行熱敷，并對乳房局部按摩，疏通乳導(dǎo)管，擠出阻塞淤汁，消除結(jié)塊。在哺乳期間，乳頭導(dǎo)管開放，而產(chǎn)后不斷有惡露排除，極易造成乳房感染?？捎贸胤试硭潦?，盡量保持乳區(qū)的干凈清潔，定期更換干土、墊料，注意清掃。斷奶期間乳基部組織松弛，可佩戴乳罩做好護(hù)理，以防機(jī)械性損傷[10-12]。

2.5.3淘汰與隔離淘汰慢性和未能治愈乳房炎病羊，防止感染健康母羊。隔離病羊，患病羊要與健康羊分開飼養(yǎng)以免傳染，并且擠奶器具等應(yīng)單獨使用，注意消毒。病羊奶應(yīng)毀棄。

3討論

從湖羊乳房炎細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果看，引起此次湖羊乳房炎病例的細(xì)菌是葡萄球菌和大腸埃希菌。葡萄球菌是環(huán)境常在菌，在正常情況下，可以在健康羊的乳房表面分布。大腸埃希菌在自然界中分布十分廣泛，正常情況下不引發(fā)疾病，當(dāng)飼養(yǎng)管理不良，氣候條件突變或其他疾病等協(xié)同作用時，會引起發(fā)病[13-14]。

由于引起湖羊乳房炎的病原菌種類在不同的羊場基本相同，但數(shù)量相差比較大，說明該病的發(fā)生與當(dāng)?shù)匮驁霏h(huán)境衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理條件以及季節(jié)性變化等諸多因素有關(guān)。因此，在治療前有必要作病原菌的測定，明確其致病菌，并通過藥敏試驗，篩選出敏感藥物進(jìn)行治療，以提高療效。與此同時加強飼養(yǎng)管理、改善衛(wèi)生條件可以很好地預(yù)防該病的發(fā)生。

在進(jìn)行乳房炎治療時，藥物選擇極為關(guān)鍵。在本次試驗中，篩選的敏感藥物進(jìn)行治療時，效果明顯比不敏感的藥物青霉素和鏈霉素效果好。由于青霉素和鏈霉素使用較為頻繁，反復(fù)多次使用容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，從而影響應(yīng)有的療效。這也提示我們在進(jìn)行治療時，應(yīng)該科學(xué)合理用藥，即在進(jìn)行藥物治療時，先進(jìn)行敏感藥物的篩選，在選擇合適的藥物后，還要注意輪換用藥，減少同一種藥物使用的頻率，從而減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)率。在實際生產(chǎn)中，應(yīng)堅持科學(xué)的飼養(yǎng)管理，建立健全合理的飼養(yǎng)管理制度。及時清掃，保持圈內(nèi)衛(wèi)生，加強日常的消毒措施，積極做好預(yù)防工作。

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Isolation and Identification of Main Pathogenic Bacteria Causing Hu Sheep Mastitis

LI Qiang1,WANG Gai-ling2,ZHAO Ze-hui1,HE Xiao-li1,XU Li-hua1

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan，Ningxia，750021,China;2.CollegeofBiologicalEngineering,HuanghuaiUniversity,Zhumadian，Henan，463000,China)

Abstract:This paper aimed to understand the mastitis incidence in a Hu sheep farm,identify the main pathogenic bacteria and determine drug resistance,finally provide theoretical basis and scientific guidance for the prevention and treatment of Hu sheep mastitis.The bacteria were isolated from milk samples and identified and the drug sensitivity test was conducted.The result showed that Staphylococcus aureus and Escherichia coli in 30 strains of isolated bacteria were the main pathogens in Hu sheep mastitis,including 8 strains of Staphylococcus for 26.7% and 22 strains of Escherichia coli for 73.3%.Drug sensitivity test showed that two kinds of pathogens were highly sensitive to florfenicol and doxycycline,but resistant to amoxicillin,spectinomycin and pefloxacin.According to the results,the measures were made for treatment and prevention of mastitis in this Hu sheep farm.

Key words:Hu sheep;mastitis;bacterial isolation and identification;drug sensitivity test;prevention and treatment

文章編號:1007-5038(2016)04-0127-04

中圖分類號:S858.26;S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B

作者簡介：李強(1991-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物研究。*通訊作者

基金項目：寧夏奶牛育種專項(2013NYYZ0501)

收稿日期：2015-09-30