彭忠利，鄒智坤，曾　澤，張　斌，岳　華，馮浩媛，湯　承

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

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藏綿羊瘤胃中產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌的分離鑒定

彭忠利，鄒智坤，曾澤，張斌，岳華，馮浩媛，湯承*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

摘要：2013年10月，采集10份四川阿壩藏族羌族自治州若爾蓋藏綿羊瘤胃內(nèi)容物。采用高溫水浴，富集培養(yǎng)的方法進(jìn)行芽胞桿菌的分離，并使用剛果紅染色法進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌的初步篩選，共獲得101株產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌。通過16 S rRNA序列測定對分離出的芽胞桿菌鑒定出3種不同的芽胞桿菌，其中短小芽胞桿菌78株、蠟樣芽胞桿菌14株、枯草芽胞桿菌9株。本研究鑒定了藏綿羊瘤胃中芽胞桿菌的組成，為進(jìn)一步利用芽胞桿菌開發(fā)藏綿羊源的益生菌奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藏綿羊；瘤胃內(nèi)容物；產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌；分離鑒定

芽胞桿菌作為動物機(jī)體的益生菌，是一種相當(dāng)完美的微生態(tài)飼料添加劑，具有幫助動物消化吸收，分泌多種腸道消化酶，提高飼料報(bào)酬，增強(qiáng)動物對疾病抵抗力，保持動物體內(nèi)正常的胃腸道菌群平衡等作用[1-2]。楊偉平等[3]從藏香豬盲腸內(nèi)容物中分離到1株產(chǎn)酶能力強(qiáng)的枯草芽胞桿菌，王炳曉等[4]從奶牛瘤胃液中分離出較強(qiáng)分解纖維素能力的蘇云金芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌。藏綿羊作為青藏高原所特有的養(yǎng)殖動物，長期生息在海拔3 000 m以上的高原牧區(qū)，其對嚴(yán)寒、空氣稀薄等高原惡劣生態(tài)環(huán)境具有良好的適應(yīng)能力[5]。藏綿羊作為一種反芻動物，在天然放牧的環(huán)境下，其瘤胃細(xì)菌在牧草的消化吸收具有重要的作用，在纖維素分解的途徑中具有重要而特別的功能，研究它們的具體機(jī)理，對增強(qiáng)纖維素利用能力和發(fā)現(xiàn)藏綿羊瘤胃發(fā)酵規(guī)律都有重大意義。為此，本研究對來自四川阿壩藏族羌族自治州若爾蓋縣10份藏綿羊瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌的分離鑒定，為青藏高原藏綿羊瘤胃生理研究和微生物菌群結(jié)構(gòu)提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集2013年10月，采集10份四川阿壩藏族羌族自治州若爾蓋藏綿羊瘤胃內(nèi)容物。采集方法為：無菌打開瘤胃后，取45 mL瘤胃內(nèi)容物裝入無菌采樣管中，置于4℃樣品箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑TSA培養(yǎng)基，杭州微生物有限公司產(chǎn)品；增菌液，CMC-Na固體培養(yǎng)基和產(chǎn)纖維素酶篩選培養(yǎng)基，西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)教研室自制；DNA Markers，北京天根公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶(5 U/μL )、dNTPs，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑由本單位實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3主要儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermoforma公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)centrifuge 5804，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀my cyclerTM、核酸電泳儀powerpac universalTM、凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；超純水儀Milli-Q，法國Millipore公司產(chǎn)品；核酸蛋白檢測儀DU800，美國Beckman公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1芽胞桿菌的分離參考文獻(xiàn)[6]將采集的瘤胃內(nèi)容物置于4℃冰箱保存，取20 mL經(jīng)無菌紗布過濾振蕩搖勻，加入20 mL PBS稀釋，取2 mL稀釋液加入8 mL生理鹽水，搖勻后，置于80℃水浴20 min；取10%接種量接種于增菌肉湯中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h～48 h；取1 mL增菌液，加入9 mL生理鹽水倍比稀釋至10-3、10-4、10-5，無菌涂布至CMC-Na平板和TSA平板，置于37℃厭氧條件和需氧條件分別培養(yǎng)24 h～72 h，挑取單菌落進(jìn)行純化。

1.2.2產(chǎn)纖維素酶的芽胞桿菌的篩選將純化好的菌株點(diǎn)種至產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h～72 h；配制5 g/L的剛果紅染液，利用它對篩選培養(yǎng)基染色30 min，倒掉染液并用水沖洗，加入適量50 g/L的NaCl溶液脫色30 min～60 min，篩選出產(chǎn)纖維素酶的菌株。將篩選出的菌株繼續(xù)在TSA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)15 h，取新鮮菌體進(jìn)行革蘭染色并鏡檢。

1.2.3分離菌16 S rRNA的PCR鑒定 用改進(jìn)CTAB法對初步篩選到的101株產(chǎn)纖維素芽胞桿菌進(jìn)行DNA的提取[7]，根據(jù)已建立的芽胞桿菌的PCR檢測方法[8]對提取的DNA進(jìn)行檢測，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列為：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC - 3′。對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒,對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

2結(jié)果

2.1產(chǎn)纖維酶芽胞桿菌的篩選

采用剛果紅染色法檢測芽抱桿菌產(chǎn)纖維素酶情況，共篩選到101株產(chǎn)纖維素芽胞桿菌。結(jié)果顯示，具有產(chǎn)纖維素酶能力的芽胞桿菌在平板上生長出單菌落并且分泌出纖維素酶，分解菌落周圍的羧甲基纖維素鈉，剛果紅因缺少大分子的羧甲基纖維素鈉結(jié)合而被沖掉，菌落周圍產(chǎn)生明顯的顯色圈(圖1)。

2.2革蘭染色結(jié)果

觀察產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌在TSA培養(yǎng)基上面的菌落的生長情況(圖2)，并且挑取新鮮菌落進(jìn)行革蘭染色(圖3)。按菌落形態(tài)和菌體革蘭染色形態(tài)大概分為3種：第1種：菌落形態(tài)圓形、菌落大、邊緣不光滑、中間有隆起、乳白色不透明，革蘭染色為藍(lán)色、菌體較大、棒形、有芽胞；第2種：菌落形態(tài)圓形、菌落較大、光滑、邊緣整齊、乳白色不透明，革蘭染色為紫色、菌體較大、長棍形、有芽胞：第3種：菌落形態(tài)圓形、菌落大、邊緣整齊、中間有凹陷、乳白稍有透明，革蘭染色為紫色、菌體極小、短棒形、有芽胞。

圖1　部分產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌剛果紅染色情況

2.3PCR鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳(圖4)結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段約為1 500 bp，與預(yù)期相符。用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中已收錄芽胞桿菌相應(yīng)的基因序列對比分析，發(fā)現(xiàn)101株分離芽胞桿菌中有短小芽胞桿菌78株、蠟樣芽胞桿菌14株、枯草芽胞桿菌9株。

A.菌落形態(tài)圓形、邊緣不光滑、中間有隆起、乳白色不透明；B.菌落形態(tài)圓形、光滑、邊緣整齊、乳白色不透明；C.菌落形態(tài)圓形、邊緣整齊、中間有凹陷、乳白稍有透明

A.The bacterial colony is circular,unsmooth in surface,convex in center,opaque milky white;B.The bacterial colony is circular,smooth,neat in edge,opaque milky white;C.The bacterial colony is circular,neat in edge,concave in center,milky white,slightly transparent

圖2芽胞桿菌菌落形態(tài)

Fig.2The colony morphology ofBacillus

A.革蘭染色為藍(lán)色、棒狀；B.革蘭染色為紫色、長棒狀；C.革蘭染色為紫色、短棒狀

A.Gram staining for blue,rod-shaped;B.Gram staining for purple,long rod-shaped;C.Gram staining for purple,short rod-shaped

圖3芽胞桿菌顯微鏡下形態(tài)

Fig.3The microscopic morphology ofBacillus

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.陰性對照;1.樣品

M.DNA Marker DL 2 000;N.Negative control；1.Sample

圖4分離菌的16 S rRNA 的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.4PCR results of 16 S rRNA of isolated bacteria

3討論

藏綿羊是我國特有的動物品種，可終年放牧，以飼草維持其正常的生長發(fā)育和繁殖。其瘤胃是代謝牧草纖維素的主要器官。在本研究中，從瘤胃分離出78株短小芽胞桿菌。蠟樣芽胞桿菌14株，枯草芽胞桿菌9株。其中短小芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌是農(nóng)業(yè)部規(guī)定可以飼喂動物的，具有很好的益生潛力。瘤胃中細(xì)菌數(shù)量巨大，種類極其復(fù)雜，芽胞桿菌可以被認(rèn)為是瘤胃細(xì)菌的一類。鄧慧媛[9]從奶牛瘤胃中分離到了短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等8種芽胞桿菌。從本研究結(jié)果來看，短小芽胞桿菌可能是藏綿羊瘤胃共生菌。它適應(yīng)了特定的氣候和瘤胃的環(huán)境，可以更好發(fā)揮產(chǎn)酶效益，幫助藏綿羊消化和吸收纖維素。很多蠟樣芽胞桿菌由于攜帶腸毒素基因，是條件致病菌，但也一部分蠟樣芽胞桿菌同樣可以被用作益生菌。Roos T B等[10]使用一種蠟樣芽胞桿菌的變種，作為一個(gè)潛在的佐劑，用于提高抗牛皰疹病毒疫苗功效，在動物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，增加了機(jī)體IFN-γ、IL-12和IL-10的細(xì)胞因子mRNA水平，表明蠟樣芽胞桿菌可以提高疫苗的功效，增強(qiáng)動物免疫力。

纖維素酶也是一種重要的飼料用酶制劑，它能幫助瘤胃消化纖維素，提高瘤胃對纖維素的降解率進(jìn)而提高飼料利用率[11]。在自然界中存在著可以許多產(chǎn)生纖維素酶的微生物，包括真菌、細(xì)菌和放線菌，其中芽抱桿菌分泌的纖維素酶具有較強(qiáng)的活性。本研究篩選芽胞桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶能力，為了解藏綿羊瘤胃中微生物組成提供參考，為進(jìn)一步利用芽胞桿菌開發(fā)藏綿羊源的益生菌奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

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Isolation and Idenfication of Cellulase-producingBacuillusStrains in Tibetan Sheep Rumen

PENG Zhong-li,ZOU Zhi-kun,ZENG Ze,ZHANG Bin,YUE Hua,FENG Hao-yuan,TANG Cheng

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu，Sichuan,610041,China)

Abstract:In october 2013,10 Tibetan sheep rumen content samples were collected in a slaughter house of Ruoergai County,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture,Sichuan.Bacillus were isolated with the high temperature water bath and the method of enrichment culture.The preliminary screening of cellulase producing Bacillus were conducted by using Congo red staining.101 strains of cellulase producing Bacillus were obtained.Through the 16 S rRNA sequence determination,3 species of Bacillus were identified,including,78 strains of Bacillus pumilus,14 strains of Bacillus cereus,9 strains of Bacillus subtilis.In this stu-dy,the compositions of Bacillus in Tibetan sheep rumen were identified for further utilization of Bacillus from Tibetan sheep to develop the probiotics.

Key words:Tibetan sheep;rumen content;cellulase producing Bacillus;isolation and identification

文章編號:1007-5038(2016)04-0070-04

中圖分類號:S852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：彭忠利(1964-)，男，四川巴中人，博士，主要從事動物營養(yǎng)與飼料學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014JQ0044)；2015年四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)活動(S201510656056)

收稿日期：2015-07-15