陳　玨，於　悅，高　想，蔣鳳榮

1.江蘇省南通市中醫(yī)院(江蘇南通 226001)；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)

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白藜蘆醇調(diào)控大鼠心力衰竭模型氧化應(yīng)激相關(guān)基因的作用

陳玨1，於悅1，高想1，蔣鳳榮2

1.江蘇省南通市中醫(yī)院(江蘇南通 226001)；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)

摘要：目的探討白藜蘆醇調(diào)控大鼠心力衰竭模型氧化應(yīng)激相關(guān)基因的作用。方法 采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備SD大鼠心力衰竭模型，測(cè)定心臟重量指數(shù)變化， Real-Time PCR定量分析超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素氧合酶(HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SOD。結(jié)果白藜蘆醇干預(yù)組和模型組比較，心臟重量指數(shù)改善，高劑量組更為顯著；心衰大鼠SOD、GPx、 HO-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，白藜蘆醇干預(yù)后，SOD、GPx、 HO-1表達(dá)水平均有所升高，其中以SOD改善明顯(P<0.0 5)，高劑量組SOD表達(dá)甚至高過假手術(shù)組。結(jié)論 白藜蘆醇能提高大鼠心力衰竭模型心肌各氧化相關(guān)基因的表達(dá)，改善心功能。

關(guān)鍵詞：心力衰竭；白藜蘆醇；氧化應(yīng)激；大鼠；超氧化物歧化酶；血紅素氧合酶；谷胱甘肽過氧化物

腎素-血管緊張素-醛固酮(RAS)系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致心室重塑，是心力衰竭(心衰)發(fā)生和發(fā)展的基本機(jī)制。越來越多的證據(jù)顯示，氧化應(yīng)激在其中起著重要作用[1]。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立SD大鼠心衰模型，加入白藜蘆醇(resveratrol ，RES)進(jìn)行干預(yù)，定量分析氧化應(yīng)激相關(guān)基因，旨在探討白藜蘆醇對(duì)大鼠心衰模型氧化應(yīng)激的作用。

1材料與方法

1.1藥品與試劑白藜蘆醇，由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司生產(chǎn)，純度>98%，抗體(SOD一抗，二抗IGG)由美國B&R公司提供，引物和生物試劑盒(SOD、HO-1)由南京生物工程有限公司提供，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模SD大鼠24只，雄性，體重(220±10)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]。參照文獻(xiàn)[2]采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心力衰竭模型。2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg進(jìn)行腹腔麻醉，剪毛，開腹并分離暴露腹主動(dòng)脈，在雙側(cè)腎動(dòng)脈間分離該處腹主動(dòng)脈，將直徑0.6 mm的針灸針與腹主動(dòng)脈平行，1號(hào)線結(jié)扎固定，拔出針灸針，造成腹主動(dòng)脈縮窄，依次縫合肌層和皮膚，術(shù)后每日腹腔注射0.1 mL慶大霉素預(yù)防感染。

1.3實(shí)驗(yàn)分組假手術(shù)組除開腹暴露、分離雙側(cè)腎動(dòng)脈間腹主動(dòng)脈但不行縮窄處理外，其余步驟與模型組一致。24只大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和RES低劑量組、RES高劑量組，各組6只，所有動(dòng)物常規(guī)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[許可證號(hào)：SYXK(蘇)2005-0009]。

1.4給藥方法假手術(shù)組：手術(shù)分離腹主動(dòng)脈，不進(jìn)行縮窄處理，手術(shù)4周后雙蒸水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。模型組：造模4周后，雙蒸水灌胃，1次/日，連續(xù)4周。RES低劑量組(低劑量組)：造模4周后，RES10 mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續(xù)4周。RES高劑量組(高劑量組)：造模4周后， RES40 mg/kg，1次/日，用雙蒸水稀釋后灌胃，連續(xù)4周。

1.5心臟重量指數(shù)(HWI)測(cè)定沿主動(dòng)脈根部游離心臟，剔除大血管殘端、筋膜及脂肪組織。測(cè)定心臟重量，計(jì)算HWI(HWI=心臟重量/動(dòng)物體重)。

1.6Real-Time PCR定量分析氧化相關(guān)基因超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、血紅素氧合酶(HO-1)表達(dá)水平。用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。Real-Time PCR反應(yīng)體系包括1 μL的cDNA模板(1%的RT產(chǎn)物)、7.5 μL SYBR Green Mix(Takara)及10 μmol/L終濃度的上、下游引物(SOD的上游引物：5′-CAAGCGGTGAACCAGTTGTG-3′，下游引物：5′-TGAGGTCCTGCACTGGTAC-3′；GPx的上游引物：5′CCTCAAGTACGTCCGACCAG 3′，下游引物：5′TTCCATGCGATGTCATTGCG3′；HO-1的上游引物：5 ′-GAATTCAGCATGCCCCAGGATTTG-3′，下游引物：5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′)，加入H2O補(bǔ)足15 μL，擴(kuò)增條件為95℃ 5 s總變性以及95℃ 5 s、 60 ℃ 31 s循環(huán)40次。目的基因的mRNA水平用β-actin(上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3′、下游引物：5′-TTCATCTTCATGGTGCTAGGA-3′)內(nèi)參校正，并將假手術(shù)組細(xì)胞的表達(dá)水平設(shè)定為1。所有樣品每個(gè)基因的PCR反應(yīng)均為3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.7免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SOD心肌組織常規(guī)切片，脫蠟、脫水后，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶；PBS沖洗，小牛白蛋白封閉；加入一抗4℃過夜；PBS沖洗，加入二抗室溫40 min，PBS沖洗，加入DAB顯色，蘇木素淡染，鏡下觀察。主要SOD為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。

2結(jié)果

2.1心臟重量指數(shù)模型組與假手術(shù)組相比，大鼠心臟重量指數(shù)明顯增加，RES干預(yù)組心臟重量指數(shù)低于模型組，且高劑量組對(duì)心臟重量指數(shù)的改善優(yōu)于低劑量組。詳見圖1。

圖1各組大鼠心臟重量指數(shù)比較

2.2各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組、高劑量組HO-1及GPx指標(biāo)均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，模型組SOD水平明顯低于假手術(shù)組，而低劑量RES組、高劑量RES組表達(dá)較假手術(shù)組無明顯增減(P>0.05)，高劑量組SOD表達(dá)甚至高于假手術(shù)高組水平；與模型組比較，低劑量組、高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均有所升高，其中SOD、HO-1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，GPx表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)(P>0.05)。詳圖2。

圖2各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.3各組大鼠SOD比較免疫組織化學(xué)檢測(cè)(SP法，×200倍)假手術(shù)組心肌細(xì)胞質(zhì)中見一定量的棕黃色顆粒，模型組中棕黃色顆粒明顯減少，低劑量組和高劑量組棕黃色染色明顯增多，以高劑量組棕黃色顆粒最為明顯。

3討論

心力衰竭指各種心臟結(jié)構(gòu)和(或)功能性疾病導(dǎo)致心室的充盈及(或)射血能力受損的一種復(fù)雜的臨床綜合征，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿[2]。心腦血管疾病與癌癥業(yè)已成為我國慢性病病人的兩大最主要死亡原因[3]。一個(gè)多世紀(jì)以來，人們對(duì)心衰發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了體液潴留、血流動(dòng)力學(xué)異常、神經(jīng)激素異常及心室重塑等不同階段[4]。目前普遍認(rèn)為心室重構(gòu)是心衰發(fā)生發(fā)展的核心基礎(chǔ)，而氧自由基可損傷心肌細(xì)胞膜，改變離子通道，促進(jìn)膠原合成，加劇心肌細(xì)胞損傷和心肌纖維化，進(jìn)而促進(jìn)心室重構(gòu)。因此，抑制心室重構(gòu)、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，理論上可延緩慢性心衰病的發(fā)展。

白藜蘆醇化學(xué)名為3，4，5三羥基-1，2二苯乙烯，屬于非黃酮類多酚化合物，因具有心血管保護(hù)作用而備受關(guān)注[5-9]。天然白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、花生等植物中，是植物抗紫外線照射和真菌感染等不利因素產(chǎn)生的一種防御素。并可在虎杖、決明子等中藥中提取獲得。藥理學(xué)研究證實(shí)虎杖具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的擴(kuò)血管作用；虎杖水煎液對(duì)離體心臟的收縮具有明顯的增強(qiáng)作用，可能與Ca2+、α受體、β受體有關(guān)?；⒄炔粌H能提高心肌對(duì)缺氧的耐受能力，而且對(duì)缺氧心肌有保護(hù)作用，究其原因，可能與含有白藜蘆醇相關(guān)[10]。近年的研究表明，白藜蘆醇心血管保護(hù)作用是通過多靶點(diǎn)多途徑來實(shí)現(xiàn)的，如抗細(xì)胞凋亡，抗血小板凝集、抗低密度脂蛋白氧化，減少心肌缺血及再灌注損傷等。

心臟壓力負(fù)荷過重是引起心肌肥厚及最終導(dǎo)致心衰的主要原因之一。腹主動(dòng)脈血管阻力上升直接導(dǎo)致左心室后負(fù)荷增加，進(jìn)而刺激心肌細(xì)胞肥大并伴心肌纖維間質(zhì)增生，室壁增厚，出現(xiàn)心肌肥厚。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎大鼠腹主動(dòng)脈造成壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型，結(jié)果顯示，模型大鼠心重指數(shù)高于假手術(shù)組，而白藜蘆醇干預(yù)組可降低心重指數(shù)，且高劑量白藜蘆醇組改善心重指數(shù)的程度優(yōu)于低劑量組，說明白藜蘆醇能有效降低心肌肥厚小鼠的心重指數(shù)，對(duì)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展有一定緩解作用。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化防御體系受損和活性氧(ROS)過量生成，從而導(dǎo)致潛在性損傷的病理過程[11]。本研究結(jié)果顯示，心衰模型大鼠氧自由基清除酶SOD、HO-1、GPX均呈現(xiàn)活性下降，說明充血性心力衰竭時(shí)機(jī)體的抗氧化能力減弱，機(jī)體處于相當(dāng)強(qiáng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。白藜蘆醇干預(yù)后上述氧自由基清除酶活性提高，且和白藜蘆醇劑量呈正比，表明白藜蘆醇通過調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)基因，抑制心衰模型的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善心功能，可能是白藜蘆醇對(duì)心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

現(xiàn)階段心力衰竭的治療以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌的激活為主流，療效尚不能令人滿意。本研究結(jié)果提示，抗氧化應(yīng)激可能成為心衰治療新的靶點(diǎn)，并為中藥干預(yù)心衰的機(jī)制提供思路和依據(jù)。其作用的分子信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

The Influence of Resveratrol on the Myocardial Oxidation Related Genes in Rat Models with Heart Failure

Chen Jue，Yu Yue，Gao Xiang，Jiang Fengrong

Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nantong 226001，Jiangsu，China Corresponding Author：Gao Xiang

Abstract：Objective To observe the effect of resveratrol(RES) on the myocardial oxidation related genes in rat models with heart failure(HF).MethodsSprague-Dawley (SD) rat models with HF were established by partially banding abdominal aortic artery.The cardiac fibrosis was evaluated by heart weight index(HWI).The expression of superoxide dismutase (SOD 1)，heme oxygenase (HO-1)，glutathione peroxidase (GPX) were measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).SOD was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with model group，HWI was significantly increased in RES group，especially RES high dose group.The expression levels of SOD1，GPx，HO-1 were decreased in model group(P<0.01 or P<0.05).The expression levels of SOD1，GPx，HO-1 were increased in RES group(P<0.05)， especially SOD.The activity of SOD in RES high dose group was higher than that in sham operation group.ConclusionRES can improve the expression of the myocardial oxidation related genes in rats with heart failure.

Key words：heart failure；resveratrol；oxidative stress；rat；Superoxide dismutase；heme oxygenase；glutathione peroxidase

(收稿日期：2016-02-02)

中圖分類號(hào)：R541R289

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.07.011

文章編號(hào)：1672-1349(2016)07-0704-003

通訊作者：高想， E-mail：ntgx1964@163.com

基金項(xiàng)目：江蘇省南通市人才工作專項(xiàng)基金(No.s8008)