張琳琳，王　凱，孫偉明，王一夫

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津　300150，2.天津中醫(yī)藥大學，天津　300193）

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從NSCs關(guān)鍵調(diào)控基因Neurogenin1初探益腎化濁方改善阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)學習記憶能力的作用機制研究*

張琳琳1，王凱2，孫偉明2，王一夫2

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300150，2.天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

摘要：[目的]觀察益腎化濁方對阿爾茨海默?。ˋD）模型大鼠海馬區(qū)Neurogenin1（ngn1）基因、GFAP和Tubulin蛋白表達的影響，初探益腎化濁方改善AD模型大鼠學習記憶能力的作用機制。[方法]雄性SD大鼠隨機分為5組，即假手術(shù)組、模型組、益腎化濁方低、中、高劑量組。治療組給予益腎化濁方低、中、高劑量分別為2.8、5.6、11.2 g/kg，1次/日，共灌胃4周。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測海馬區(qū)ngn1基因表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測GFAP和Tubulin蛋白表達的變化。[結(jié)果]與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)ngn1基因表達下降，GFAP蛋白表達增加，Tubulin蛋白表達顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，益腎化濁方低、中、高劑量組大鼠海馬區(qū)ngn1基因表達升高，GFAP蛋白表達減少，Tubulin蛋白表達顯著升高。[結(jié)論]益腎化濁方可能通過增加AD模型大鼠海馬區(qū)ngn1基因表達，促進神經(jīng)元再生，進而改善其學習記憶功能。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。灰婺I化濁方；ngn1；GFAP；Tubulin

1　材料

1.1動物雄性SD大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量（200± 30）g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部（許可證號：SZXK（京）2011-00120）。

1.2藥物及試劑益腎化濁方組成：女貞子10 g，淫羊藿10 g，補骨脂10 g，石菖蒲12 g，炙黃芪10 g，川芎10 g。煎煮步驟及條件參照王凱等[4]方法。制成生藥濃度為0.62 g/mL，存于4℃冰箱。β樣淀粉蛋白片段25-35（Aβ25-25，Sigma公司，批號：053M4804V），GFAP（abcam公司，批號：ab68428），Anti-TubulinbetaIII isoform（Millipore公司，批號：MAB1637），β-actin（CST公司，批號：4970s），Trizol（批號：R0016）、BeyoRT M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（批號：D7159）、BeyoRT cDNA第一鏈合成試劑盒（RNase H-）（批號：D7166）、cDNA第二鏈合成試劑盒（批號：D7172）均購自碧云天公司、RT-PCR kit（Sigma公司，批號：GS0030）。

1.3儀器高速離心機Neofuge 13R（Heal Force上海力申科學儀器有限公司），分光光度儀（上海坤肯生物化工有限公司），-80℃低溫冰箱（Haier），垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（北京市六一儀器廠），RG-3000型實時定量PCR儀（德國Qiagen公司）。

2　方法

2.1動物模型制備參照Miguel等[5]方法制備Aβ25-35。模型制備參照楊曉娟等[6]方法。

2.2分組與給藥采用隨機數(shù)字表法將50只大鼠隨機分為5組，即假手術(shù)組、模型組、益腎化濁方低、中、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，益腎化濁方低、中、高劑量組參照徐叔云《藥理實驗方法學》[7]1 mL濃煎劑含0.62 g生藥，故予益腎化濁方2.8，5.6，11.2 g/kg，灌胃每日1次，共灌胃4周。

2.3大鼠海馬區(qū)GFAP、Tubulin蛋白表達檢測取大鼠海馬裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度后采用Western blot凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，4℃靜置過夜。洗滌后加入二抗孵育，充分洗滌后利用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，借助凝膠成像系統(tǒng)顯影。圖像結(jié)果采用image J軟件分析。

2.4大鼠海馬區(qū)ngn1基因表達檢測按照Trizol試劑盒提取總RNA，每組總RNA濃度為1 g/L，1 μg RNA加入Oligod（T）7 μL及7 μL水，72℃變性10 min，取出立即置于冰上2 min。后加入反轉(zhuǎn)體系6.5 μL，PCR儀中42℃反應50 min，50℃反應10 min。在逆轉(zhuǎn)錄體系中按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為：95℃，4 min后，執(zhí)行95℃，30 s，56℃，30 s，60 cycles，觀察熒光定量熔解度。引物序列見表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer sequence

2.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件分析處理，計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊用Dunnett’sT3以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1行為學檢測Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期時間延長，穿越平臺次數(shù)減少，而加入藥物干預后，大鼠逃避潛伏期時間縮短，穿越平臺次數(shù)增加，參照王凱等[4]檢測結(jié)果。

3.2海馬區(qū)GFAP、Tubulin蛋白表達Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)GFAP蛋白相對表達量顯著升高，Tubulin蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，益腎化濁方低、中、高劑量組大鼠海馬區(qū)GFAP蛋白相對表達量顯著下降，Tubulin蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但3組之間無統(tǒng)計學差異。見表2，圖1。

3.3海馬區(qū)ngn1基因表達RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ngn1基因相對表達量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，益腎化濁方低、中、高劑量組大鼠ngn1表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但三組間比較無統(tǒng)計學意義。見表3。

表2　各組AD大鼠海馬區(qū)GFAP和Tubulin蛋白相對表達量(±s)Tab.2 GFAP and Tubulin in the hippocampus of AD rats in each group(±s)

表2　各組AD大鼠海馬區(qū)GFAP和Tubulin蛋白相對表達量(±s)Tab.2 GFAP and Tubulin in the hippocampus of AD rats in each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組益腎化濁方低劑量組益腎化濁方中劑量組益腎化濁方高劑量組劑量（g/kg）GFAP/ β-actin動物數(shù)10 10 10 10 10 Tubulin/ β-actin 0.70±0.08　 2.13±0.17-　 1.27±0.03*　 1.58±0.05* 2.8　 0.95±0.08#　2.73±0.05#5.6　 0.91±0.09#　2.73±0.06#11.2　 0.82±0.03#　2.96±0.06#

圖1　GFAP和Tubulin在海馬區(qū)的表達Fig.1 Expression of GFAP and Tubulin in the hippocampus

表3　各組AD大鼠海馬區(qū)ngn1基因相對表達量(±s)Tab.3 Expression of ngn1 in the hippocampus of AD rats in each group(±s)

表3　各組AD大鼠海馬區(qū)ngn1基因相對表達量(±s)Tab.3 Expression of ngn1 in the hippocampus of AD rats in each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別　動物數(shù)劑量（g/kg）　ΔCT　 ΔΔCT　2-ΔΔCT假手術(shù)組模型組益腎化濁方低劑量組益腎化濁方中劑量組益腎化濁方高劑量組10 10 10 10 10 3.99±1.23　 0.00±1.23 1.00（0.43～2.35）-　 5.00±0.58　 1.01±0.58 0.49（0.67～1.49）* 2.8 3.31±0.59 -0.68±0.59 1.60（0.66～1.51）#5.6 3.00±0.72 -0.99±0.72 1.98（0.61～1.65）#11.2 2.79±0.88 -1.20±0.88 2.30（0.54～1.84）#

4　討論

Aβ沉積導致的神經(jīng)元丟失是AD的主要病理特征，既往人們認為成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）缺乏再生能力，神經(jīng)系統(tǒng)受損后不能通過神經(jīng)細胞的增殖來替代丟失的神經(jīng)元。而NSCs的發(fā)現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供了一條新思路。

NSCs既可向神經(jīng)元分化，也可向星形膠質(zhì)細胞分化，該過程會受相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[8]。ngn1作為堿性-螺旋-環(huán)-螺旋基因（bHLH）家族成員之一，在NSCs分化過程中具有競爭性調(diào)控其向神經(jīng)元分化的關(guān)鍵作用[9-10]。ngn1表達增加，既有利于啟動神經(jīng)元特異性基因Tubulin的表達，使NSCs進入神經(jīng)元分化狀態(tài)[11]，又可以引起星形膠質(zhì)細胞特異性基因GFAP的沉默[12]，最終阻斷星形膠質(zhì)細胞的分化通路。因此適當增加ngn1基因的表達，進而調(diào)控NSCs向神經(jīng)元方向分化以彌補其丟失，已成為減緩AD進展的潛在治療方法。

前期研究發(fā)現(xiàn)，針對老年性癡呆腎精虧虛為本、痰濁瘀阻于腦絡為標的病機特點[13]，投用益腎化濁方切中肯綮[2]。方中諸藥合用下滋本元，上通腦竅，陰陽并補，標本兼治?，F(xiàn)代研究也表明其組分具有促進神經(jīng)干細胞增殖，并誘導其向神經(jīng)元分化的作用[3，14]。但具體作用機制尚不清楚。

因此本研究從調(diào)控ngn1基因角度入手，對益腎化濁方改善的AD模型大鼠學習記憶能力的作用機制做一初探。結(jié)果顯示，益腎化濁方治療后顯著增加了模型大鼠海馬區(qū)ngn1基因的表達，進而減少了GFAP蛋白的表達，增加了Tubulin蛋白的表達，從而改善了其學習記憶能力。提示益腎化濁方改善AD模型大鼠學習記憶能力可能與增加ngn1基因的表達有關(guān)，而具體的作用機制尚需進一步研究。

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（本文編輯：高杉，馬英）

The mechanism study of Yishen Huazhuo decoction on improving the learning and memory ability of rats with Alzheimer's disease by Neurogenin1

ZHANG Lin-lin1，WANG Kai2，SUN Wei-ming2，WANG Yi-fu2
（1. The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin, 300150,China; 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China）

Abstract:[Objective] To explore the influence of Yishen Huazhuo decoction（YHD）on the expression of Neurogenin1（ngn1），GFAP，and Tubulin in hippocampus of Alzheimer's disease（AD）model rats，and try to explore the mechanism of YHD in improving learning and memory of AD rats. [Methods] SD rats were randomized into five groups：sham operation group，model group，low-dosage，mediumdosage，and high-dosage YHD group. The dosage of low，medium，high YHD is 2.8，5.6，11.2 g/kg，respectively，once a day，four weeks in total. RT-PCR for ngn1，western blot for GFAP and Tubulin. [Results] Compared with sham operation group，model group rats hippocampus ngn1 gene expression decreased，increased expression of GFAP protein，Tubulin protein expression were significantly decreased，with significant difference（P＜0.05）. Compared with model group，three YHD group hippocampus ngn1 gene expression increased，decreased expression of GFAP protein，and increased Tubulin，with significant difference. [Conclusion] YHD might increase ngn1 in hippocampus of Alzheimer's AD model rats，promote neuronal regeneration thereby improving learning and memory function.

Key words:Alzheimer's disease；Yishen Huazhuo decoction；ngn1；GFAP；Tubulin

收稿日期：（2015-12-20）

作者簡介：張琳琳（1984-），女，博士研究生，住院醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦病的臨床、科研與教學工作。阿爾茨海默病（AD）又稱老年性癡呆，是一種以記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化導致的神經(jīng)元丟失([1])。益腎化濁方來源于張伯禮院士主持的國家“九五”科技攻關(guān)課題“益腎化濁法治療老年期血管性癡呆的研究”基礎上組方形成。前期研究結(jié)果表明，該方可改善AD患者認知功能([2])，其組分具有誘導神經(jīng)干細胞（NSCs）向神經(jīng)元分化的能力([3])。本實驗擬從調(diào)控NSCs分化的關(guān)鍵基因Neurogenin1（ngn1）入手，初探益腎化濁方改善AD模型大鼠學習記憶能力的可能作用機制。

*基金項目：國家自然科學基金項目（81202654）。

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.04.13

中圖分類號：R749.1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-1519（2016）04-0238-03