韓卓然 石洪玥 孫敬鋒 王一澤 邢克智

摘要：【目的】探明神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）在大菱鲆（Scophthalmus maximus）腦組織中的分布情況，為揭示大菱鲆腦組織中一氧化氮（NO）的生理功能提供形態(tài)學(xué)資料。【方法】分別采用NADPH-d組織化學(xué)染色法和免疫組織化學(xué)法對(duì)大菱鲆腦組織中的nNOS進(jìn)行定位研究?！窘Y(jié)果】NADPH-d組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，大菱鲆大腦皮質(zhì)中有藍(lán)色的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維存在。神經(jīng)元呈梭形、錐形等形狀，神經(jīng)纖維呈串珠狀且無(wú)序交織；小腦中NOS陽(yáng)性神經(jīng)元在分子層分布稀疏，在顆粒層分布密集，浦肯野細(xì)胞胞核淡染。經(jīng)免疫組織化學(xué)法染色后，可觀察到大腦皮質(zhì)中nNOS免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈深棕色；小腦皮質(zhì)的分子層、顆粒層及浦肯野細(xì)胞層均有nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布，浦肯野細(xì)胞呈免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)?！窘Y(jié)論】大菱鲆腦組織中的NOS類型主要限于nNOS，且nNOS在神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，也進(jìn)一步證實(shí)NO在不同物種中具有一些共同的作用，但不同物種或相同物種不同組織中NO分布及含量存在差異。

關(guān)鍵詞： 大菱鲆；神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）；一氧化氮（NO）；腦組織；分布；免疫組織化學(xué)定位

中圖分類號(hào)： S965.399 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）02-0296-05

0 引言

【研究意義】一氧化氮（NO）是一種效應(yīng)分子和細(xì)胞信使分子，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有反應(yīng)性強(qiáng)、易擴(kuò)散、性質(zhì)活潑不穩(wěn)定、生物半衰期非常短等特點(diǎn)，廣泛存在于生物體內(nèi)的各組織器官中，參與機(jī)體的多種生理及病理過(guò)程（鄔曉敏和金成，2005）。在NO生成過(guò)程中，一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOS）是必不可少的酶，根據(jù)其存在的細(xì)胞類型可分為3種亞型（梁潤(rùn)梅，2003；馬倩倩等，2013）：第一種是神經(jīng)型一氧化氮合成酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS），存在于神經(jīng)元和神經(jīng)纖維中，其主要生物效應(yīng)是在細(xì)胞間傳遞信息，具有傳遞和調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用；第二種是誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要存在于巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，iNOS在正常生理?xiàng)l件下不表達(dá)，只有在脂多糖、細(xì)胞因子、細(xì)菌和病毒刺激下才被激活表達(dá)；第三種是內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS），主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中。因此，對(duì)大菱鲆（Scophthalmus maximus）腦組織NOS進(jìn)行定位研究，可為揭示大菱鲆腦組織中NO的生理功能提供形態(tài)學(xué)資料?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自Hope等（1991）提出神經(jīng)元性依賴還原型輔酶Ⅱ黃遞酶（NADPH-d）即NOS后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者便開(kāi)始采用NADPH-d組織化學(xué)染色法研究NOS在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞定位。隨著對(duì)NOS分子生物學(xué)性質(zhì)認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NOS與NADPH-d尚存在許多本質(zhì)性的差異，如分子量、氨基酸序列和酶活性結(jié)構(gòu)域等，利用NADPH-d組織化學(xué)法也無(wú)法區(qū)分NOS的3種亞型。而免疫組織化學(xué)法是利用抗原與抗體結(jié)合的特性，能準(zhǔn)確區(qū)分NOS的亞型。已有學(xué)者利用NADPH-d組織化學(xué)染色結(jié)合免疫組織化學(xué)方法證實(shí)，在高等動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在nNOS，由nNOS催化產(chǎn)生的NO在神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳導(dǎo)和生理活動(dòng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用（梁閏梅，2003；Singru et al.，2003，2007；Salchner et al.，2004；Yu et al.，2013）。但在現(xiàn)有的相關(guān)研究中，其對(duì)象主要是人類及鼠、兔、豬等哺乳動(dòng)物，研究重點(diǎn)也多集中于患病、應(yīng)激等特殊情況下nNOS的表達(dá)及其表達(dá)對(duì)機(jī)體生理機(jī)能的影響（Mishra et al.，2006；Rao et al.，2011；Ling et al.，2012；張朝再等，2014；Zou et al.，2015），僅有少數(shù)針對(duì)魚(yú)類nNOS定位研究的報(bào)道，如馬倩倩等（2013）、Biswas等（2015）分別對(duì)半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）腦組織中nNOS進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】nNOS在腦組織中參與了化學(xué)信號(hào)感受、運(yùn)動(dòng)、內(nèi)臟活動(dòng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等復(fù)雜的生理過(guò)程（Aley et al.，1998；王曉安等，2007），且不同種類動(dòng)物nNOS的分布及表達(dá)量差異顯著，但此類研究在魚(yú)類中開(kāi)展得相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】運(yùn)用NADPH-d組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)兩種方法對(duì)大菱鲆腦組織nNOS的分布及定位進(jìn)行研究，揭示大菱鲆腦組織中NO的生理功能，也為不同魚(yú)類nNOS研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大菱鲆購(gòu)自天津市西青區(qū)王頂?shù)趟a(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，健康無(wú)病，體長(zhǎng)32.1 cm，體重550.0 g。β-NADPH、NBT、三卡因購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MS-222、Triton X-100、L-多聚賴氨酸、蘇木素染劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；一抗（兔抗小鼠nNOS）、二抗（山羊抗兔IgG）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記鏈親和素、DAB/H2O2染色試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1. 2 樣品采集及處理

將大菱鲆用MS-222進(jìn)行麻醉，然后用100 mL生理鹽水快速?zèng)_洗魚(yú)體表面。在冰盤上取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定5 h，然后移入20%蔗糖磷酸緩沖液中浸泡至組織沉底，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 NADPH-d組織化學(xué)染色

冷凍切片（厚度為15 μm）用PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；于37 ℃下β-NADPH孵育液（0.3% Triton X-100、1 mg/mL NBT、0.6 mg/mL β-NADPH、0.1 mol/L PBS）孵育3 h；然后將切片移入蒸餾水中15 min；常規(guī)脫水、透明、封片。

1. 4 免疫組織化學(xué)定位

切片在3%過(guò)氧化氫—甲醇溶液中37 ℃孵育30 min，以阻斷內(nèi)源性酶活性；再經(jīng)10%正常山羊血清恒溫（37 ℃）封閉10 min；切片滴加稀釋后的一抗（兔抗小鼠nNOS），置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，再用生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育1 h；隨后將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液滴加到各冰凍切片的組織上，37 ℃恒溫箱孵育30 min。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。經(jīng)DAB/H2O2染色后用蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADPH-d組織化學(xué)染色結(jié)果

從NADPH-d組織化學(xué)染色的大菱鲆大腦組織中，可觀察到染成藍(lán)色的神經(jīng)纖維相互無(wú)序交織（圖1-a），神經(jīng)纖維部分呈串珠狀，神經(jīng)元細(xì)胞核著色較淺，能清楚看到突觸（圖1-b）。藍(lán)色的神經(jīng)元呈梭形或錐形等多種形狀，呈陽(yáng)性反應(yīng)的神經(jīng)元胞漿可觀察到明顯的藍(lán)色顆粒物質(zhì)（圖1-c）。小腦分子層中藍(lán)色神經(jīng)元細(xì)胞分布稀疏（圖2-a），而顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞分布密集，呈顆粒狀，均染成藍(lán)色。浦肯野細(xì)胞胞核淡染，胞質(zhì)被染為藍(lán)色，呈陽(yáng)性（圖2-b）。

2. 2 免疫組織化學(xué)定位結(jié)果

經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，大菱鲆腦組織中的nNOS免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈深棕色。在大腦皮質(zhì)可觀察到nNOS免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，均呈深棕色，神經(jīng)纖維相互交織呈網(wǎng)狀（圖3）。小腦皮質(zhì)的分子層、顆粒層及浦肯野細(xì)胞層均有nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布（圖4-a），浦肯野細(xì)胞呈免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)（圖4-b）。

3 討論

NO是一種特殊的神經(jīng)信息物質(zhì)，在信息傳遞、神經(jīng)發(fā)育、介導(dǎo)興奮性毒性、調(diào)節(jié)神經(jīng)再生等生理過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用（鄔曉敏和金成，2005）。內(nèi)源性NO是由L-精氨酸經(jīng)過(guò)NOS催化作用而產(chǎn)生，形成了一個(gè)NO-NOS體系，因此NOS分布情況可揭示組織中NO的作用部位（Gourdon et al.，2001）。本研究結(jié)果表明，大菱鲆腦組織經(jīng)NADPH-d組織化學(xué)染色后，可觀察到大量呈陽(yáng)性反應(yīng)的神經(jīng)纖維和神經(jīng)元。陳小囡等（2002）通過(guò)NADPH-d組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元在鳙（Aristichthys nobilis）的小腦部分十分密集，神經(jīng)元胞體體積較大，呈三角形、圓形或卵圓形。大菱鲆和鳙同為硬骨魚(yú)類，在親緣關(guān)系上距離較近，致使nNOS在兩種魚(yú)類腦部的分布情況十分相似。王曉安和蔣小滿（2005）對(duì)口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）進(jìn)行NADPH-d組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)其腦神經(jīng)節(jié)中并無(wú)NADPH-d陽(yáng)性細(xì)胞胞體存在，但有少量來(lái)自腹神經(jīng)鏈的陽(yáng)性纖維進(jìn)入腦神經(jīng)節(jié)。雖然大菱鲆與口蝦蛄同為海生動(dòng)物，但兩種生物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故導(dǎo)致其神經(jīng)系統(tǒng)NOS陽(yáng)性細(xì)胞分布存在較大差異。

由于NADPH-d組織化學(xué)染色法無(wú)法直接區(qū)分NOS的3種亞型，為此本研究同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法對(duì)nNOS進(jìn)行定位，結(jié)果表明，大菱鲆大腦皮質(zhì)及小腦皮質(zhì)的分子層、顆粒層和浦肯野細(xì)胞層均存在nNOS，故推斷nNOS作為神經(jīng)分子參與了神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程。沈偉哉等（2002）以大鼠腦干為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nNOS免疫組化陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕褐色，細(xì)胞核淡染，陽(yáng)性神經(jīng)元胞體呈梭形、三角形或圓形等形狀，有一個(gè)或多個(gè)突起；nNOS免疫組化陽(yáng)性纖維呈棕色串珠狀，且交錯(cuò)分布。馬倩倩等（2013）通過(guò)免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)，nNOS位于半滑舌鰨大腦神經(jīng)元胞漿內(nèi)，陽(yáng)性神經(jīng)纖維相互交織呈網(wǎng)狀；小腦顆粒層有nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布，分子層內(nèi)可觀察到陽(yáng)性神經(jīng)纖維和浦肯野細(xì)胞。以上研究結(jié)果在本研究中得到進(jìn)一步證實(shí)。但孫虎山等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)nNOS免疫組化染色均呈陰性，可能是櫛孔扇貝為低等動(dòng)物種類，且不同種類動(dòng)物、不同組織的nNOS分布及數(shù)量存在差異所致。

4 結(jié)論

大菱鲆腦組織中的NOS類型主要限于nNOS，且nNOS在神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，也進(jìn)一步證實(shí)NO在不同物種中具有一些共同的作用，但不同物種或相同物種不同組織中NO分布及含量存在差異。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）