孫清榮 孫洪雁 周廣芳

摘要：為了建立棗優(yōu)良新品種魯棗3號(hào)的莖段不定芽再生體系，以其幼嫩莖段為外植體，研究了不同基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生的影響。結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基WPM比MS顯著提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，WPM上的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，但不能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。TDZ對(duì)不定芽的再生比6-BA更有效，成功誘導(dǎo)愈傷組織獲得了14.9%的不定芽再生率，而6-BA未能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。魯棗3號(hào)莖段適宜的不定芽再生培養(yǎng)基為：MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：魯棗3號(hào)；莖段；愈傷組織；不定芽

中圖分類號(hào)：S665.101

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）02-0012-03

棗（Zizyphus juijuba Mill.）是鼠李科棗屬多年生落葉木本果樹(shù)，原產(chǎn)地中國(guó)。紅棗營(yíng)養(yǎng)豐富、富含維生素，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，但由于棗樹(shù)在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常受到一些病蟲害危害，制約了紅棗產(chǎn)量。通過(guò)育種方法可以進(jìn)行棗樹(shù)品種的抗性改良，但由于棗胚敗育率高及落花落果嚴(yán)重等，利用常規(guī)雜交育種方法很難達(dá)到品種改良的目的?；蚬こ痰耐庠椿蜻z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物體細(xì)胞誘變技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)方法的發(fā)展為植物新品種的選育和改良提供了育種新途徑，該技術(shù)的成功應(yīng)用主要依賴于植物高效再生體系的建立。因此，建立棗樹(shù)的高效再生體系是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段改良品種的首要步驟。

棗離體葉片不定梢誘導(dǎo)研究報(bào)道較多，但以棗嫩莖切段為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。魯棗3號(hào)是2010年山東省審定的極早熟鮮食棗新品種，為了更好地利用、保存和改良這一品種，本試驗(yàn)研究了其莖段不定芽再生技術(shù)，為種苗的無(wú)性快繁、品種資源的離體保存及利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良品種奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他品種莖段不定芽再生誘導(dǎo)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山東省果樹(shù)研究所棗樹(shù)資源圃種植的棗樹(shù)新品種魯棗3號(hào)成年大樹(shù)。

1.2 培養(yǎng)基

愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）及3-吲哚丁酸（IBA），設(shè)置4種不同培養(yǎng)基處理（表1）。

不定芽的增殖培養(yǎng)基：WPM+2mg/L6-BA+1mg/LKT+0.5mg/L IBA。

生根培養(yǎng)基：1/4MS+1mg/L IBA。

所有培養(yǎng)基均添加蔗糖3%，瓊脂0.6%，在滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.8。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng) 從生長(zhǎng)健壯的魯棗3號(hào)樹(shù)上剪取半木質(zhì)化棗頭嫩枝，去掉葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，剪取去掉兩端腋芽的節(jié)間莖段，用洗衣粉水清洗，再用自來(lái)水沖洗30min以上，控凈水，置于超凈工作臺(tái)上的無(wú)菌燒杯內(nèi)。先用70%酒精殺菌1min，再用5%次氯酸鈉殺菌8min，期間搖動(dòng)3-5次，用無(wú)菌水洗4～5次，將材料置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)橫切成0.2cm左右的小段，橫切面向下接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1）。每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種10個(gè)，重復(fù)3次。接種后置于光周期為16h/8h（光/暗）、光強(qiáng)為40μmol·m-2·S-l、溫度為（25+2）℃的條件下培養(yǎng)，7周后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及不定芽再生率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的莖段數(shù)/接種總莖段數(shù)xl00

不定芽再生率（%）=產(chǎn)生不定芽的莖段數(shù)/接種總莖段數(shù)×100

1.3.2 不定芽伸長(zhǎng)、增殖和生根培養(yǎng)將不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖和伸長(zhǎng)培養(yǎng)。選取1.0cm以上的健康綠梢，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，置黑暗條件下培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)到光周期為16h/8h（光/暗）的光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，4周后統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率（%）=生根株數(shù)/接種總梢數(shù)×100

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理平均值用LSD法進(jìn)行差異比較分析，檢驗(yàn)0.05水平下差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組成對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1可知，4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)魯棗3號(hào)莖段產(chǎn)生愈傷組織，其中WPM基本培養(yǎng)基處理的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%，顯著高于MS基本培養(yǎng)基。

外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用因基本培養(yǎng)基的不同而表現(xiàn)不同。在WPM培養(yǎng)基上，TDZ和6-BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用無(wú)明顯差異；在MS培養(yǎng)基上，TDZ比6-BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)更有效，二者的愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著（表1）。

2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)不定芽分化的影響

由表1可知，WPM培養(yǎng)基上的愈傷組織均未能分化不定芽。在MS基本培養(yǎng)基上添加1mg/LTDZ和0.2mg/L IBA時(shí)，可成功誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽（圖1A），不定芽再生率為14.9%；而添加6-BA的MS培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)愈傷分化不定芽。由此可見(jiàn)，不定芽的分化受基本培養(yǎng)基和外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相互作用的影響。盡管WPM能高效誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，但不能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽。結(jié)果表明，誘導(dǎo)魯棗3號(hào)莖段不定芽再生的適宜培養(yǎng)基為MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

2.3 不定芽的生長(zhǎng)與增殖

將不定芽轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基WPM+2mg/L 6-BA+1mg/L KT+O.5mg/L IBA培養(yǎng)基上，表現(xiàn)為既有伸長(zhǎng)生長(zhǎng)也有增殖生長(zhǎng)（圖1B）。

2.4 生根誘導(dǎo)

伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的不定梢在生根培養(yǎng)基上獲得了生根小植株（圖1C），生根率為85.4%。

3 結(jié)論與討論

以棗樹(shù)葉片為外植體進(jìn)行不定梢誘導(dǎo)的研究報(bào)道較多，但因基因型不同，其獲得的再生率也不同。莖段不定芽再生的研究雖也有報(bào)道，但所用外植體為帶芽莖段，表現(xiàn)為在切口處產(chǎn)生不定芽。本研究是以節(jié)間（去掉兩端芽）莖段為外植體，首次成功獲得了再生不定芽。

本研究中，基本培養(yǎng)基WPM比MS雖然顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但WPM培養(yǎng)基上添加TDZ或6-BA均未獲得不定芽再生，而在MS培養(yǎng)基上添加TDZ成功獲得了不定芽，這與前人在MS培養(yǎng)基上獲得帶芽棗莖段不定芽再生的結(jié)論相一致，但所添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同，表明外植體或基因型不同，不定芽再生所需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同。

TDZ是比6-BA細(xì)胞分裂素活性更強(qiáng)的類細(xì)胞分裂素物質(zhì)，更有利于誘導(dǎo)木本植物不定芽的再生。本研究結(jié)果表明：TDZ對(duì)于誘導(dǎo)魯棗3號(hào)莖段的不定芽再生比6-BA更有效，這與誘導(dǎo)棗葉片不定芽再生時(shí)TDZ比6-BA有效的研究結(jié)果一致。

本研究雖成功獲得了魯棗3號(hào)莖段不定芽的再生，但再生率低，不能有效應(yīng)用于生物技術(shù)育種研究，如何進(jìn)一步提高再生率還需深入研究。