許文勝 康文磊 陳永軍 楊增華 張 濤

作者單位：014010 內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨三科

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石榴籽油對(duì)雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量的影響及分子機(jī)制的研究

許文勝 康文磊 陳永軍 楊增華 張 濤

作者單位：014010 內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨三科

【摘要】目的 觀察石榴籽油對(duì)雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響，觀察相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，分析探討其作用機(jī)制。方法 將30只雌性KM小鼠按體重隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，除空白對(duì)照組實(shí)施假手術(shù)外，其余2組全部在麻醉下切除卵巢制作成骨質(zhì)疏松癥模型，分別給實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組喂食普通飼料和添加一定劑量的石榴籽油的飼料，4周后擬對(duì)小鼠股骨近端骨小梁微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)4周后3組動(dòng)物采血獲得其血清，利用體外血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，研究3組動(dòng)物血清對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物股骨近端骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞程度最為嚴(yán)重，其次為實(shí)驗(yàn)組，空白組骨小梁微結(jié)構(gòu)正常；石榴籽油代謝物（CLA9C）抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化，通過(guò)增加堿性磷酸酶（ALP）活性和基質(zhì)礦化促進(jìn)成骨，同時(shí)，主要的轉(zhuǎn)錄水平（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN and成骨細(xì)胞標(biāo)記物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈現(xiàn)上調(diào)。結(jié)論 石榴子油可以抑制雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥骨量的丟失同時(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞活性。

【關(guān)鍵詞】石榴籽油；雌激素相關(guān)骨質(zhì)疏松癥；骨量的影響；分子機(jī)制

近年來(lái)，有關(guān)石榴食用和藥用價(jià)值的研究越來(lái)越為人們所關(guān)注，石榴籽油富含不飽和脂肪酸-石榴酸，具備多種藥理功能，本研究旨在觀察石榴籽油對(duì)雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥小鼠股骨近端骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響，觀察相關(guān)組織形態(tài)學(xué)變化，分析探討其作用機(jī)制，為預(yù)防和治療女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供安全、經(jīng)濟(jì)、有效的食物或藥物做初步探討。

1 材料與方法

1.1 建立動(dòng)物模型、分組和膳食干預(yù)

將30只雌性KM小鼠按體重隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，除空白對(duì)照組實(shí)施模擬手術(shù)外，其余2組全部在麻醉下切除卵巢制作成骨質(zhì)疏松癥模型，給模擬組和實(shí)驗(yàn)組喂食普通飼料和添加5%石榴籽油的飼料，4周后麻醉下處死小鼠，取出雙側(cè)股骨加以檢測(cè)分析。

1.2 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨近端進(jìn)行5 μm厚非脫灰組織切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）進(jìn)行染色。形態(tài)學(xué)計(jì)量用與光學(xué)纖維鏡相連的半自動(dòng)顯微圖像分析儀（型號(hào)：TRH-JX2000A/B），對(duì)股骨近端二次海綿骨組織構(gòu)造，進(jìn)行定量分析，內(nèi)容包括骨的骨量/組織量、骨小梁厚度和骨小梁間距，并對(duì)酒石酸抵抗性酸性磷酸酶陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。

1.3 模型動(dòng)物體外血清實(shí)驗(yàn)

將30只8周齡的KM小鼠（購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）經(jīng)過(guò)1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為2組（n=15），一組是PSO組，另一組是普通對(duì)照組，PSO組每天的灌胃劑量為200 μg，對(duì)照組使用相同的劑量，10 d后，麻醉下心臟抽血離心（3 000 r/min，5 min室溫），去上清液，與同一組動(dòng)物血清混合，過(guò)濾45 μm，分裝并儲(chǔ)存在-80℃直到細(xì)胞使用到培養(yǎng)基為止。

以最適濃度的NF-k B受體活化因子配體（RANKL）作為誘導(dǎo)劑，在體外細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，待破骨細(xì)胞分化成熟后，通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法進(jìn)行破骨細(xì)胞鑒定，并采用real-time PCR方法檢測(cè)各不同處理組之間，破骨細(xì)胞表型基因及功能基因NF-κB受體活化因子（RANK）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、破骨細(xì)胞降鈣素受體（CTR）、組織蛋白酶K（CTSK）、趨化因子受體CCR2和整合素基因β3 （ITG-β3）的mRNA表達(dá)的差異。經(jīng)過(guò)體外特定培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，檢測(cè)細(xì)胞的增殖及基因的表達(dá)量，對(duì)骨堿性磷酸酶（ALP）、骨保護(hù)素基因（OPG）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、盤狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2）、Ⅰ型膠原蛋白（Coll1a1）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

詳見(jiàn)圖1～2。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（POP）是老年婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病，是以骨量減少，骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞，脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為主要特征的全身性骨骼系統(tǒng)疾病［1］。絕經(jīng)后婦女的卵巢功能減退，骨組織失去雌激素的保護(hù)作用，使骨轉(zhuǎn)換率升高，骨吸收增多，骨丟失加速，此過(guò)程可持續(xù)5～10年，尤以絕經(jīng)后的前3年骨丟失速度最快。當(dāng)絕經(jīng)后婦女的骨量減少，骨密度（BMD）值低于骨峰值2.5標(biāo)準(zhǔn)差（SD）以上即為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，因此雌激素缺乏是骨丟失加快的重要因素。

3.1 雌激素通過(guò)受體調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮直接作用

一方面促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和膠原合成以及與骨礦化相關(guān)蛋白的合成，另一方面抑制破骨細(xì)胞功能活性，并誘導(dǎo)其凋亡［2］，抑制破骨細(xì)胞的形成與骨吸收之間的平衡，此外，雌激素還通過(guò)鈣代謝激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響3種鈣代謝激素的分泌；雌激素還可通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)調(diào)節(jié)雌激素及受體的合成。通過(guò)上述3條途徑，雌激素能防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

3.2 植物性雌激素防治骨質(zhì)疏松的作用

植物雌激素防治骨質(zhì)疏松作用機(jī)制已經(jīng)研究到分子水平［3］，主要有以下5個(gè)方面。（1）ER基因組作用機(jī)制：植物雌激素主要通過(guò)結(jié)合并激活ERα和ERβ發(fā)揮骨保護(hù)作用，對(duì)ERβ的親和力高于ERα［4］；（2）ER非基因組作用機(jī)制：植物雌激素激活細(xì)胞膜ER引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，如磷脂酶C有絲分裂原激活蛋白激酶（MAP K）的激活；（3）過(guò)氧化物酶增殖子激活受體介導(dǎo)機(jī)制：過(guò)氧化物酶增殖子激活受體（PPARs）是植物雌激素關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄靶受體，也屬于核受體超家族，有α、γ和δ（或β）3種亞型，植物雌激素低濃度時(shí)以ER介導(dǎo)的作用為主，表現(xiàn)為骨生成增加、脂肪生成減少；高濃度時(shí)以PPARγ介導(dǎo)的作用為主，表現(xiàn)為脂肪生成增加、骨生成減少；（4）OPG/RANKL/ANK介導(dǎo)機(jī)制［5］：護(hù)骨素（OPG）、核因子-κB（受體活化因子RANK及其配體RANKL（RANK ligand）在破骨細(xì)胞的生成激活和存活中起重要作用，成骨細(xì)胞在骨微環(huán)境中對(duì)破骨細(xì)胞的整體功能發(fā)揮直接作用，包括對(duì)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，植物雌激素可能通過(guò)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)產(chǎn)生骨保護(hù)作用；（5）酶抑制作用機(jī)制：已證實(shí)異黃酮類是一種酪氨酸激酶抑制劑，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)途徑，抑制蛋白激酶和酪氨酸激酶，從而引起破骨細(xì)胞凋亡抑制骨吸收，也可以通過(guò)抑DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性來(lái)減少破骨細(xì)胞形成。

圖1 3組動(dòng)物股骨近端骨小梁微結(jié)構(gòu)變化比較

圖2 對(duì)特定細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

3.3 石榴籽油的結(jié)構(gòu)與理化特性

石榴籽油（PSO）是唯一植物來(lái)源的多不飽和共軛脂肪酸，由石榴籽通過(guò)化學(xué)工藝萃取而來(lái)，其主要含有六種脂肪酸：石榴酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等。而石榴酸是石榴籽油的最主要成分，約占86%。石榴酸的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

圖3 石榴酸分子結(jié)構(gòu)

因石榴酸的結(jié)構(gòu)與共軛亞油酸（CLA）最為接近而將其稱為”超級(jí)共軛亞油酸”，近些年國(guó)內(nèi)外研究表明，石榴籽油具有多種藥理作用，包括抗氧化、清除自由基和抗衰老；抗基因突變與抗癌作用；降低血壓、血糖、血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能；雌激素樣作用；抗腹瀉、抑制大腸桿菌等致病菌的生長(zhǎng)及其腸毒素的產(chǎn)生等；其中雌激素樣作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面表明［6］，以含石榴提取物的溶液喂飼卵巢切除的大鼠，更年期癥狀得到有效緩解，即大鼠的增重得到控制，子宮重量有所增加，骨質(zhì)流失受到抑制，抑郁癥狀減輕，更年期的持續(xù)時(shí)間縮短，各項(xiàng)骨骼組織參數(shù)均接近正常大鼠的水平。石榴緩解更年期綜合癥的作用與其所含類雌激素物質(zhì)具有參與脂代謝、保留骨質(zhì)、增強(qiáng)中樞腎上腺系統(tǒng)的功能和類雌激素樣作用有關(guān)。

3.4 石榴籽油對(duì)雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量的影響

石榴富含類固醇激素和植物雌激素，其中植物雌激素對(duì)人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，即當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，它們直接與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素效應(yīng)；當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較高時(shí)，它們與雌醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，從而表現(xiàn)出抗雌激素作用。雌激素能促進(jìn)成骨細(xì)胞中TGF-β的產(chǎn)生，表明這些生長(zhǎng)因子對(duì)骨形成有促進(jìn)作用，雌激素通過(guò)這些生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，促進(jìn)骨形成［7］。實(shí)驗(yàn)表明［8］，當(dāng)雌激素缺乏，骨髓單核細(xì)胞分泌IL-1和間質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6都增多，切除卵巢的患者體內(nèi)TNF-α和GM-CSF水平升高，接受雌激素治療的患者TNF-α和GM-CSF恢復(fù)到正常水平。以上細(xì)胞因子對(duì)骨吸收過(guò)程有促進(jìn)作用，雌激素通過(guò)抑制上述細(xì)胞因子的產(chǎn)生而抑制骨吸收。骨密度是用單位面積或體積內(nèi)的礦物質(zhì)含量來(lái)表示骨密度測(cè)定是直接反映骨礦物質(zhì)丟失的敏感指標(biāo)，其在骨量丟失5%時(shí)雙能X線骨密度儀即可檢出。本實(shí)驗(yàn)小鼠股骨近端進(jìn)行5 μm厚非脫灰組織切片，并用酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（TRAP）進(jìn)行染色。形態(tài)學(xué)計(jì)量用與光學(xué)纖維鏡相連的半自動(dòng)圖像分析儀，對(duì)股骨近端二次海綿骨組織構(gòu)造，進(jìn)行定量分析表明，石榴籽油具有抑制雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量減少的作用，其抑制骨量減少的作用機(jī)制可能與促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞增殖有關(guān)。

3.5 石榴籽油抑制骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量的丟失分子機(jī)制的探討

Ahmed等研究發(fā)現(xiàn)石榴果提取物可抑制軟骨外植體中白介素-1β誘導(dǎo)的蛋白多糖的分解。6.25～25 mg、L的石榴果實(shí)提取物即可在細(xì)胞水平上將白介素-1β誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1，MMP-3，MMP-13蛋白的表達(dá)水平抑制到中等水平［9］。本研究表明，給骨質(zhì)疏松癥小鼠喂食5%石榴籽油飼料，4周后采血，利用體外血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，研究石榴籽油對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：石榴籽油可能通過(guò)下調(diào)破骨細(xì)胞的基因表達(dá)抑制破骨細(xì)胞的活性。在體外血清試驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)特定破骨細(xì)胞分化標(biāo)記物的表達(dá)（MMP9，CTR，和TRAP等）進(jìn)一步驗(yàn)證了石榴籽油代謝物（CLA9C）抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化是通過(guò)下調(diào)其特定地基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，另一方面，對(duì)成骨細(xì)胞胚胎前體的MC3T3-E1細(xì)胞加以培養(yǎng)，通過(guò)增加堿性磷酸酶（ALP）活性和證明基質(zhì)礦化來(lái)推測(cè)石榴籽油血清能促進(jìn)成骨，同時(shí)，主要的轉(zhuǎn)錄水平因子（ALP，Coll1a1，BSP，OCN，OPG，OPN 和成骨細(xì)胞系標(biāo)記物（DDR2，Coll1a1，ALP等）呈現(xiàn)上調(diào)的結(jié)果。在培養(yǎng)體系中加入不同比例的石榴籽油和玉米油，通過(guò)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞分化因子MMP9，CTR，ITG β3，RANK-RANKL的表達(dá)以及MC3T3-E1細(xì)胞DDR2，Coll1a1，BSP等的表達(dá)證實(shí)了石榴籽油對(duì)特定細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，石榴籽油作為石榴果實(shí)的重要組成部分，對(duì)雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥骨量丟失方面具有抑制作用。同時(shí)石榴籽油作為一種天然果實(shí)成分，有可能成為女性絕經(jīng)后防治骨質(zhì)疏松癥方面安全、有效而經(jīng)濟(jì)的食品或藥物之一。

參考文獻(xiàn)

［1］ 劉忠厚. 骨礦與臨床［M］. 北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2006: 903-905.

［2］ Cheskis BJ，Greger JG，Nagpal，et al. Signaling by estrogens［J］.J Cell Physiol，2007，213（3）: 610-617.

［3］ 馬亞兵，高海青，劉新春，等. 骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與治療的循證醫(yī)學(xué)研究［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究，2009，32（2）: 135-139 .

［4］ 曾婧娉，閻卉，王成港，等. 骨質(zhì)疏松癥治療藥物-艾爾骨化醇［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究，2011，34（3）: 224-229.

［5］ 許旺. 中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展［J］. 中草藥，2005，36（2）: 314-315.

［6］ Mori-Okamoto J，Otawara-Hamamoto Y，Yamato H，et al.Pomegranate extract improves a depressive state and bone properties in menopausal syndrome model ovariectomized mice［J］. J Ethnopharmacol，2004，92（1）: 93-101.

［7］ Kalu DN. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss ［M］. Bone Miner，1991，15（3）: 175-191.

［8］ Mori-Okamoto J，Otawara-Hamamoto Y，Yamato H，et al.Pomegranate extract improves a depressive state and bone properties in menopausal syndrome model ovariectomized mice［J］. J Ethnopharmacol，2004，92（1）: 93-101.

［9］ Ahmed S，Wanq N，Hafeez BB，et al. Punica granatum L. Extract Inhibits IL-1β-Induced Expression of Matrix Metalloproteinases by Inhibiting the Activation of MAP Kinases and NF-kB in Human Chondrocytes In Vitro［J］. J Nutr，2005，135（9）: 2096-2102.

Molecular Mechanism for Pomegranate Seed Oil Prevents Bone Loss in A Mice Model of Osteoporosis Through the Regulation of Estrogen

XU Wensheng KANG Wenlei CHEN Yongjun YANG Zenghua ZHANG Tao Department of Third Osteology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Baotou Medical，Baotou 014010，China

【Abstract】

Objective To study the molecular mechanism for pomegranate seed oil in prevention of bone loss in a osteoporosis mice model. Methods Accordded to the weight randomly divided 30 KM female mice into 5 groups: pomegranate seed oil low，medium and high dose group，normal group，model group，after 4 weeks detected the bone density，mineral structure and affect on uterus. Results Bone mineral density test show that low doses ofpomegranate seed oil obvious decreased estrogen caused by a lack of BMD，middle dose of pomegranate seed oil completely inhibit the decline，high does of pomegranate seed oil compared with normal group，significantly increased bone mineral density，low doses of pomegranate seed oil significantly suppressed spongy bone bone loss，bone trabecular width decreased and the increase of bone trabecular spacing and was completely inhibited by middle dose of pomegranate seed oil，and high doses of pomegranate seed oil significantly increased bone mass and bone trabecular width. Mild，high doses of pomegranate seed oil inhibits a drop in the quality of the uterus. Conclusion Pomegranate seed oil can inhibit bone loss of estrogen related osteoporosis and can promote osteoblast differentiation at the same time，inhibit the osteoclast activity.

【Key words】Pomegranate seed oil，Osteoporosis regulation of estrogen，Prevents bone loss，Molecular mechanism

基金項(xiàng)目：包頭市社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目（編號(hào)：2014S2003-5-12） 內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2014MS0812）

【中圖分類號(hào)】R3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）03-0187-03

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.03.138