王維昊，林　森，王洪波，王紅娟，許偉華

山東大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科 濟(jì)南 250033

Nrf2對(duì)肝纖維化過(guò)程中炎癥細(xì)胞的影響

王維昊，林森，王洪波，王紅娟，許偉華#

山東大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科 濟(jì)南 250033

關(guān)鍵詞核因子相關(guān)因子2；中性粒細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；肝纖維化；小鼠

摘要目的：探索在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成過(guò)程中，核因子相關(guān)因子2(Nrf2)對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。方法：野生鼠和Nrf2基因敲除鼠各24只，分別隨機(jī)平均分成對(duì)照組和模型組。HE染色、Masson三色染色觀察肝組織病理學(xué)變化及肝臟纖維化程度；天狼星紅染色觀察膠原沉積情況；免疫組化方法檢測(cè)肝組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(Ly6-G陽(yáng)性)情況；免疫熒光方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及活化(ER-MP23陽(yáng)性)情況。結(jié)果：兩個(gè)對(duì)照組均未有肝纖維化表現(xiàn)；基因敲除模型組小鼠肝組織壞死及纖維化程度重于野生模型組，膠原含量更多(P<0.05)。四氯化碳誘導(dǎo)可增強(qiáng)肝組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，但基因敲除鼠中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)輕于野生模型鼠(P<0.05)。Nrf2基因敲除和四氯化碳誘導(dǎo)均增強(qiáng)肝組織中巨噬細(xì)胞的活化，兩者具有協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論：Nrf2可以通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞活化抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展。

肝纖維化是絕大部分慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制主要是肝臟損傷因素持續(xù)存在(如酒精、病毒、藥物等)，引起肝細(xì)胞變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而使肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生。各種原因?qū)е碌母卫w維化病程進(jìn)展中都伴有不同程度的氧化應(yīng)激，持續(xù)的氧化應(yīng)激可以加重肝細(xì)胞損傷、促進(jìn)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，加速肝纖維化的進(jìn)程[1]。核因子相關(guān)因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)是抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵分子，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)，減少細(xì)胞損傷[2]。前期研究[3]顯示，在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷中，相比野生鼠，Nrf2基因敲除鼠肝組織中IL-1α、TNF-α、IFN-α等炎癥介質(zhì)分泌增多，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上，作者觀察了四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化形成過(guò)程中，Nrf2對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞激活的影響，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物小鼠均由瑞士ETH大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)院提供，飼養(yǎng)于SPF條件下，體重(20±5) g，野生鼠和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)鼠各24只。

1.2藥物和試劑四氯化碳購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用礦物油稀釋至60%。Ly6-G抗體購(gòu)于瑞士BD Pharmingen公司，ER-MP23購(gòu)于Abcam公司，二抗購(gòu)于美國(guó)Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)室，ABC試劑盒購(gòu)于加拿大Vector實(shí)驗(yàn)室。

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分4組：野生對(duì)照組、Nrf2-/-對(duì)照組、野生模型組、Nrf2-/-模型組，每組12只。模型組給予礦物油稀釋的四氯化碳腹腔注射，每3 d注射1次，每次0.5 mL/kg，共注射15次，最后一次注射3 d后處死小鼠；對(duì)照組僅給予相同劑量的礦物油腹腔注射，其他操作同模型組。

1.4肝組織損傷程度及纖維化程度評(píng)價(jià)處死小鼠后，取小鼠肝臟，一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)方法制備3.5 μm厚石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色、Masson三色染色和天狼星紅染色，顯微鏡下觀察并拍照。HE、Masson染色用于觀察肝細(xì)胞壞死情況、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、纖維組織增生程度、小葉結(jié)構(gòu)是否紊亂；天狼星紅染色用于觀察膠原沉積情況。每張切片選取5個(gè)不重復(fù)視野觀察，Masson染色以藍(lán)色信號(hào)為陽(yáng)性，天狼星紅染色以紅色信號(hào)為陽(yáng)性。用IPP軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)面積與視野內(nèi)肝組織總面積之比，取平均值。

1.5肝組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞激活的檢測(cè)取另一部分肝臟置于體積分?jǐn)?shù)95%的酸性乙醇中固定，常規(guī)方法制備3.5 μm厚石蠟切片，浸入用30 g/L牛血清白蛋白、pH為7.4的PBST稀釋的Ly6-G抗體和ER-MP23抗體中4 ℃過(guò)夜，PBST搖洗3次，每次5 min，后滴加稀釋好的二抗，細(xì)胞核用Hoechst復(fù)染，37 ℃恒溫30 min后，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照。用IPP軟件定量分析：每張片子選取5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野(×20)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1肝組織病理學(xué)變化HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。野生對(duì)照組和Nrf2-/-對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織正常，未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞變性壞死。野生模型組小鼠可見(jiàn)大量肝細(xì)胞脂肪變性，中央靜脈及匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)深染的纖維結(jié)締組織；Nrf2-/-模型組小鼠肝細(xì)胞變性壞死較野生模型組更加明顯，肝板結(jié)構(gòu)消失，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有明顯纖維間隔形成。Masson三色染色結(jié)果(圖2、表1)顯示：對(duì)照組小鼠均不存在肝纖維化，Nrf2-/-模型組肝纖維化面積較野生模型組明顯增大。天狼星紅染色(圖3、表1)結(jié)果顯示；對(duì)照組小鼠均不存在肝組織膠原沉積，Nrf2-/-模型組肝組織中膠原沉積較野生模型組明顯增多。

A:野生對(duì)照組；B:Nrf2-/-對(duì)照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖1　4組肝組織HE染色結(jié)果(×20)

A:野生對(duì)照組；B:Nrf2-/-對(duì)照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖2　4組肝組織Masson三色染色結(jié)果(×20)

A:野生對(duì)照組；B:Nrf2-/-對(duì)照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖3　4組肝組織天狼星紅染色結(jié)果(×20)

%

2.2中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞激活情況見(jiàn)圖4、圖5和表2、表3。

A:野生對(duì)照組；B:Nrf2-/-對(duì)照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖4　4組Ly6-G(中性粒細(xì)胞浸潤(rùn))免疫組化染色結(jié)果(×20)

A:野生對(duì)照組；B:Nrf2-/-對(duì)照組；C:野生模型組；D:Nrf2-/-模型組。圖5　4組ER-MP23(巨噬細(xì)胞激活)免疫熒光染色結(jié)果(×20)

表24組肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)比較(n=12)陽(yáng)性細(xì)胞/mm2

模型Nrf2-+-70.839±31.88363.275±24.257+69.407±26.125127.499±42.411

F模型=11.579，P=0.001；FNrf2=7.498，P=0.009；F交互=12.660，P=0.001。

表34組肝巨噬細(xì)胞激活比較(n=12)陽(yáng)性細(xì)胞/mm2

模型Nrf2-+-59.118±27.49846.944±28.326+196.083±35.04096.150±25.731

F模型=120.473，F(xiàn)Nrf2=43.804，F(xiàn)交互=26.755，P均<0.001。

3討論

肝纖維化是肝臟受損后的一種積極的自我修復(fù)過(guò)程。無(wú)論是何種原因?qū)е碌母卫w維化，都伴隨著慢性炎癥的刺激，肝臟炎癥反應(yīng)和肝纖維化密切相關(guān)[4]。這種炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的釋放和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[5]。肝纖維化不斷進(jìn)展的一個(gè)重要的影響因素就是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激的積累可以引起蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，加重肝細(xì)胞的壞死和凋亡，還能促進(jìn)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，加重其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Nrf2作為體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，同時(shí)也具有一定的抗炎作用[6]。Nrf2可以通過(guò)上調(diào)抗氧化基因表達(dá)、抑制TGF-β等細(xì)胞因子釋放、促進(jìn)膠原降解等多途徑抑制肝纖維化的快速進(jìn)展[7]。該研究結(jié)果顯示，與野生鼠比較，四氯化碳誘導(dǎo)的Nrf2-/-小鼠肝細(xì)胞壞死和膠原沉積程度更嚴(yán)重，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的纖維化，證實(shí)Nrf2在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了抑制作用。

在肝纖維化過(guò)程中伴隨著中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增多，而且中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在一定程度上對(duì)肝纖維化有促進(jìn)作用[8-9]。但Saito等[10]的研究顯示，在膽總管結(jié)扎導(dǎo)致的肝纖維化過(guò)程中，減少中性粒細(xì)胞或使其功能缺失并不能顯著改善肝纖維化的程度，也就是說(shuō)雖然中性粒細(xì)胞已被證實(shí)可以促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程，但是其在肝纖維化形成中的作用并非關(guān)鍵。該研究結(jié)果顯示，經(jīng)四氯化碳誘導(dǎo)，野生小鼠肝組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)(Ly6-G陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加)；與野生鼠相比，Nrf2-/-鼠中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，但是肝纖維化程度卻明顯加重。之前研究[3]顯示，在四氯化碳所致的急性肝損傷時(shí)，Nrf2敲除鼠中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較野生鼠更明顯，說(shuō)明急性肝損傷中Nrf2可以在一定程度上抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。這種在急性肝損傷和慢性肝纖維化中，Nrf2對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的兩種截然不同的影響，其原因還有待進(jìn)一步探索。畢竟，肝纖維化時(shí)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞跨膜遷移過(guò)程，不僅需要炎癥介質(zhì)的吸引，還需要一些其他信號(hào)分子共同作用使中性粒細(xì)胞滲出[11]，即使在敲除Nrf2后炎癥介質(zhì)釋放增加，也可能通過(guò)影響其他信號(hào)分子使中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究?？傊?，在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化過(guò)程中，肝內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在一定程度上需要依賴Nrf2的參與。

肝臟的巨噬細(xì)胞是庫(kù)普弗細(xì)胞，在肝臟受到損傷時(shí)活化，主要通過(guò)釋放細(xì)胞因子(如TGF-β、TNF-α等)刺激肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[12]。在肝纖維化進(jìn)展階段，敲除巨噬細(xì)胞可以有效抑制肝纖維化進(jìn)展[13]。然而，巨噬細(xì)胞也可以吞噬壞死的肝細(xì)胞和增生的膠原，在肝纖維化恢復(fù)階段發(fā)揮積極的作用。有研究[14-15]顯示，在肝纖維化恢復(fù)階段，敲除巨噬細(xì)胞可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的持續(xù)積累，延緩肝臟的修復(fù)再生。這是由于在肝纖維化形成和修復(fù)階段，巨噬細(xì)胞表型不同而發(fā)揮的作用不同所致。該研究結(jié)果顯示，在肝纖維化形成過(guò)程中，Nrf2敲除鼠相比野生鼠肝內(nèi)ER-MP23陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，Nrf2敲除促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示Nrf2可能通過(guò)抑制肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

綜上所述，Nrf2作為體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化應(yīng)激分子，可以抑制四氯化碳所致的肝纖維化進(jìn)程，這種抑制作用可以通過(guò)抑制肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化而實(shí)現(xiàn)。在四氯化碳所致的肝纖維化中，Nrf2反而加重了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，這可能是Nrf2在對(duì)抗肝纖維化的積極作用中的一個(gè)不利因素，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步證實(shí)和研究。

致謝：感謝瑞士蘇黎世 ETH生物學(xué)院Sabine Werner教授提供的實(shí)驗(yàn)條件，感謝Tobias A Beyer博士提供的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

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Effects of nuclear factor-E2 related factor 2 on inflammatory cells during liver fibrosis

WANGWeihao,LINSen,WANGHongbo,WANGHongjuan,XUWeihua

DepartmentofGastroenterology,theSecondHospital，ShandongUniversity,Jinan250033

Key wordsNrf2;neutrophil;macrophage;liver fibrosis;mouse

AbstractAim: To investigate the effects of nuclear factor-E2 related factor 2(Nrf2) on infiltration of inflammatory cells from rats with CCl4-induced liver fibrosis. Methods: There were four groups including wild type(WT) control group(WT mice without CCl4-induction), WT-CCl4 group(WT mice with CCl4-induction), Nrf2 knockout(Nrf2-/-) control group(Nrf2-/-mice without CCl4-induction) and Nrf2-/--CCl4 group(Nrf2-/-mice with CCl4-induction), and 12 in each group. Histological morphology was studied by HE staining,Masson triple staining, and Sirius red staining was used to observe the deposition of collagen.Neutrophils(labelled by Ly6-G ) and macrophages(labelled by ER-MP23) infiltration were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence,respectively. Results: The two control groups had no liver fibrosis pathogenic manifestations; the liver fibrosis was more severe and collagen content was higher in Nrf2-/--CCl4 group than those in WT-CCl4 group(P<0.05).In the WT-CCl4 group,the infiltration of neutrophils were increased obviously compared with control groups,but there was a significant decrease in the Nrf2-/--CCl4 group when compared with the WT-CCl4 group(P<0.05).The macrophages were infiltrated and activated in the model groups than in the control groups,especially in the Nrf2-/--CCl4 group(P<0.05).Conclusion: Nrf2 plays a protective role in CCl4-induced liver fibrosis via inhibiting the activation of macrophages.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.013

#通信作者，女，1967年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：慢性肝病、肝纖維化，E-mail：wwh60068@163.com

中圖分類號(hào)R575.2