劉冬松，陳岳明，董學(xué)妍，張衛(wèi)英，余道軍

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江金華321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江杭州310006）

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多基因啟動子甲基化診斷乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌的研究*

劉冬松1，陳岳明2，董學(xué)妍2，張衛(wèi)英2，余道軍2

（1.浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江金華321017；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江杭州310006）

摘要：目的探討血清多基因啟動子甲基化在乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝細(xì)胞癌（HCC）中的診斷價值。方法隨機(jī)收集98例HCC、75例肝硬化（LC）、90例慢性乙型肝炎（CHB）患者以及80例健康者血清各2ml，以血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因作為候選靶標(biāo)。采用磁珠法提取血清DNA，MethyLight法檢測基因啟動子甲基化。通過構(gòu)建受試者工作特征曲線（ROC）評價各檢測指標(biāo)的診斷效能。結(jié)果血清各基因啟動子甲基化在HCC患者檢測陽性率分別為：RASSF1A（52.04％）、APC（36.73％）、BVES （29.59％）、HOXA9（20.41％）、GSTP1（17.35％）和TIMP3（11.22％），其中APC甲基化陽性完全與RASSF1A重疊。血清RASSF1A甲基化從慢性HBV感染患者中診斷HCC的效能最高［敏感性=0.520，特異性=0.915，曲線下面積（AUC）=0.718］，優(yōu)于血清AFP（敏感性=0.480，特異性=0.739，AUC=0.609）；血清6個基因啟動子甲基化聯(lián)合使用的敏感性、特異性及診斷效能進(jìn)一步提高，分別為0.806、0.855和0.845。結(jié)論血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1及HOXA9基因啟動甲基化聯(lián)合檢測能顯著提高高危人群中HCC的診斷能力。

關(guān)鍵詞：啟動子；甲基化；肝細(xì)胞癌

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的人類惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)每年可導(dǎo)致約500 000人死亡［1］。在東亞地區(qū)，HCC的主要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染［2］。當(dāng)診斷明確時，HCC患者往往已處于癌癥進(jìn)展期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已錯失有效的治療時機(jī)。目前用于HCC診斷的常用標(biāo)志物是血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），因其敏感性和特異性較低，不能作為一個良好的HCC診斷指標(biāo)。因此，尋找一種有效的篩選HCC的新標(biāo)志物是當(dāng)務(wù)之急，尤其是針對HBV相關(guān)HCC患者。

基因啟動子CpG島甲基化代表一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，往往涉及人類的致癌過程。研究資料顯示，肝臟組織中一些傳統(tǒng)的抑癌基因和調(diào)節(jié)基因啟動子異常甲基化可以作為HCC生物標(biāo)志物［3］。癌癥患者血清DNA來源于凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等，并攜帶各種DNA改變，包括DNA整合、突變以及甲基化等標(biāo)志，并且發(fā)現(xiàn)血清DNA的改變和相應(yīng)的腫瘤組織中的改變高度一致［4-5］。該研究結(jié)果表明，血清DNA中基因啟動子甲基化有可能作為HCC的無創(chuàng)診斷指標(biāo)。

本研究通過文獻(xiàn)發(fā)掘納入6個常參與消化道致癌的基因（BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9）作為候選靶標(biāo)。通過MethyLight方法來測定其在HCC、慢性乙肝后肝硬化（cirrhosis of liver，LC）、慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）及健康人群中的甲基化狀態(tài)，尋找能從CHB和LC患者中有效篩選HCC的指標(biāo)。

1　資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月-2014年12月在金華市中醫(yī)醫(yī)院就診的患者263例，包括98例HCC（HCC組），75例LC（LC組）及90例CHB患者（CHB組）。HCC診斷依據(jù)B超、計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）及血清AFP檢查結(jié)果，并最終由組織學(xué)確診。LC診斷依據(jù)B超、CT檢查患者伴有門脈高壓和脾大；CHB診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》（2010版）［6］。所有患者血清HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性，排除其他類型的肝臟疾?。ㄗ陨砻庖咝愿窝?、酒精性肝病、Wilson病和其他類型的病毒性肝炎等）及其他重大疾病。80例健康者（對照組）來自杭州市第一人民醫(yī)院體檢中心。各組年齡和性別配對。所有研究對象簽署經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的知情同意書。

1.2 血清DNA提取及亞硫酸鹽處理

抽取患者接受治療前及健康體檢者空腹靜脈血5 ml，置含促凝劑的真空采血管內(nèi)，室溫條件下2 000 g離心10 min，小心吸取2 ml血清至Eppendorf管內(nèi)，12 000 g離心5min，吸取血清至新的Eppendorf管內(nèi)，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。血清DNA分離和純化采用磁珠法試劑盒（北京金麥格公司）。采用EpiTect Bisulfite試劑盒（德國Qiagen Hilden公司）對提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鈉處理并純化，最終獲得20μl處理后DNA置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜霾僮骶丛噭┖姓f明書進(jìn)行。

1.3 陽性對照品制備

取1μg從正常胎兒臍帶血中提取的DNA，加入10 u SssⅠ甲基化轉(zhuǎn)移酶（美國NEB公司），160μmol/L SAM和緩沖液于20μl體系中反應(yīng)37℃、15 min，65℃、10 min，再按照DNA亞硫酸鹽修飾的方法加以處理和純化，產(chǎn)物置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MethyLight方法檢測基因啟動子甲基化

MethyLight方法是一種建立在TaqMan探針法實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，RT-PCR）上的甲基化定量分析技術(shù)，通過一對甲基化特異性擴(kuò)增引物和一條覆蓋若干CpG二核苷酸的水解探針，來對目的基因進(jìn)行甲基化狀態(tài)分析［7］。本實(shí)驗(yàn)以ACTB為內(nèi)參基因，來校正樣品間在模板量上的差異。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成（見表1）。反應(yīng)體系包括2×PCR Buffer 10μl、200μmol/L dNTPs、0.3μmol/L正反向引物、0.1μmol/L探針、3.5 mmol/L MgCl2、0.5 u Taq酶、修飾后DNA 1.0μl，加水至20μl（PCR試劑購自日本Toyobo公司）。使用ABI Prism? 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）在96孔板上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火1 min，共45個循環(huán)。各基因啟動子甲基化程度用甲基化比值（percentage of methylated reference，PMR）表示，PMR的計(jì)算參照參考文獻(xiàn)［7］，以PMR＞4為陽性。

表1　MethyLight方法檢測引物及探針序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)。多組間比較用單因素方差分析（One-way，ANOVA），兩兩比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比或率表示，用χ2檢驗(yàn)，診斷效能用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 臨床資料

共納入343例研究對象的臨床資料。4組患者的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、血清白蛋白（serum albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、血小板計(jì)數(shù)（Platelets，PLT）、AFP水平比較，經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.571、5.068、62.327、4.617和233.482；P=0.000、0.028、0.000、0.003和0.000）。其中HCC、LC及CHB組患者的ALT、TBIL、AFP水平與對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ALT：t=29.645、42.095和30.105，P=0.000；TBIL：t=52.502、70.328和34.206，P=0.000；AFP：t=254.778、111.592和98.263，P=0.000），HCC、LC及CHB組患者的ALT、TBIL、AFP水平均高于對照組；HCC、LC及CHB組患者的ALB、PLT水平與對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ALB：t=7.542、6.523和4.271，P=0.007、0.012和0.041；PLT：t=4.963、21.355和4.337，P=0.027、0.000和0.039），HCC、LC及CHB組患者的ALB、PLT水平低于對照組。

2.2 血清各基因啟動子甲基化陽性率

HCC、LC、CHB組及對照組BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因啟動子甲基化血清檢測陽性率見表2。HCC組患者甲基化陽性率從高到低分別為：RASSF1A（52.04％）、APC （36.73％）、BVES（29.59％）、HOXA9（20.41％）、GSTP1（17.35％）和TIMP3（11.22％），其中APC甲基化陽性完全與RASSF1A重疊。RASSF1A基因啟動子甲基化在LC患者血清中經(jīng)常被檢出（13.33％），甚至在健康人群中還有低比率陽性（3.75％）。其余5個基因在LC患者中呈現(xiàn)低比率陽性（2.67％～5.33％），而在健康人群中未檢出。見表2。

表2　血清各基因啟動子甲基化陽性率的分布　例（％）

2.3 血清各基因啟動子甲基化對HCC的診斷效能

血清RASSF1A甲基化從慢性HBV感染患者中鑒別HCC的敏感性為0.520，高于其余6個診斷指標(biāo)；BVES、APC、TIMP3、GSTP1及HOXA9甲基化的敏感性均不及AFP（≥20 ng/L），而血清各基因甲基化指標(biāo)特異性均優(yōu)于AFP（≥20 ng/L）；從慢性HBV感染患者中診斷HCC的效能排在前3位的指標(biāo)分別是血清RASSF1A甲基化（AUC=0.718）、血清APC甲基化（AUC=0.650）及AFP（≥20ng/L）（AUC=0.609）。見表3。

表3　血清各基因啟動子甲基化對HCC的診斷效能

2.4 血清基因啟動子甲基化聯(lián)合使用對HCC的診斷效能

從慢性HBV感染者中（CHB+LC）鑒別HCC，血清RASSF1A、BVES、APC、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因啟動子甲基化聯(lián)合使用的敏感性、特異性及AUC分別為0.806，0.855和0.845；血清各基因啟動子甲基化聯(lián)合AFP（≥20 ng/L）的敏感性提高至0.878，特異性降至0.763，AUC為0.852，見附圖。

A：RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+HOXA9聯(lián)合使用的ROC曲線（HCC vs CHB+LC）；B：RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+ HOXA9+AFP聯(lián)合使用的ROC曲線（HCC vs CHB+LC）附圖　血清各基因啟動子甲基化聯(lián)合使用對HCC的診斷效能

3　討論

在HBV高流行區(qū)域，基本形成從慢性肝炎到LC，甚至最終至HCC的肝臟疾病譜，且大多數(shù)HCC的發(fā)生伴隨在LC的基礎(chǔ)上［8］。因此，對慢性HBV感染人群進(jìn)行定期、規(guī)律的HCC篩查，有助于HCC的及時診治，提高患者生存期。

本研究選取常參與消化道腫瘤，特別是HCC發(fā)生的6個腫瘤相關(guān)基因（BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1及HOXA9）［9-12］。該基因涉及多種細(xì)胞功能或信號系統(tǒng)，如細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移（BVES、APC和RASSF1A）、凋亡、血管生成（TIMP3），解毒（GSTP1）以及細(xì)胞分化（HOXA9）。經(jīng)MethyLight法檢測，HCC患者血清RASSF1A甲基化陽性率最高，為52.04％（51/98），其次是APC為36.73％（36/98），而且APC陽性完全與RASSF1A陽性重疊。值得注意的是，兩者在LC及CHB均有低比率陽性；該結(jié)果表明，RASSF1A、APC甲基化可能是HCC發(fā)生、發(fā)展過程中較為普遍的一種表觀遺傳學(xué)改變，并且可能還是一個早期事件。

通過各指標(biāo)從慢性HBV感染患者中鑒別HCC的敏感性和特異性分析，6個腫瘤相關(guān)基因中只有RASSF1A甲基化的敏感性高于AFP（0.520 vs 0.480），而特異性均高于AFP；從診斷效能看RASSF1A（AUC=0.718）、APC（AUC=0.650）和BVES （AUC=0.636）均好于AFP（AUC=0.609）。通過6個基因的聯(lián)合使用，可明顯提高HCC的診斷敏感性、特異性和效能，分別為0.806、0.855和0.845，如果再聯(lián)合AFP，盡管診斷敏感性提高至0.878，但特異性明顯降至0.763。

從本研究結(jié)果來看，血清BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1及HOXA9基因啟動甲基化聯(lián)合檢測能明顯提高本地區(qū)高危人群中HCC的診斷能力。

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（申海菊編輯）

Promoter methylation of multiple genes for diagnosis of HBV-related hepatocellular carcinoma*

Dong-song Liu1，Yue-ming Chen2，Xue-yan Dong2，Wei-ying Zhang2，Dao-jun Yu2
（1. Department of Laboratory Medicine，Jinhua Traditional Chinese Medicine Hospital，Jinhua，Zhejiang 321017，China；2. Department of Laboratory Medicine，the First People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou，Zhejiang 310006，China）

Abstract:Objective To evaluate the clinical values of promoter methylation of multiple genes in serum for diagnosis of HBV-related hepatocellular carcinoma（HCC）. Methods Two milliliters of sera were prepared from each participant including 98 HCC patients，75 liver cirrhosis（LC）patients，90 chronic hepatitis B （CHB）patients and 80 healthy controls. BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1 and HOXA9 were selected as candidate genes. Serum DNA was extracted with magnetic beads and modified by sodium bisulfite treatment. The methylation of the promoters of these genes was measured with MethyLight method. Receiver operating characteristic（ROC）curves were constructed and the areas under the ROC curves（AUCs）were calculated to determine the feasibility of using serum gene methylation as a biomarker for HCC. Results The positive rates of promoter methylation of the 6 genes in serum of the HCC patients were 52.04％for RASSF1A，36.73％for APC，29.59％for BVES，20.41％for HOXA9，17.35％for GSTP1 and 11.22％for TIMP3. The HCC patients with methylated APC had methylation of RASSF1A as well. The diagnostic performance of serum methylatedRASSF1A was superior to that of AFP and the other indicators for the discrimination of the patients with HCC from those with chronic HBV infection. Furthermore，the sensitivity，specificity and AUC of combination of promoter methylation of the 6 genes obviously increased. Conclusions Combined detection of serum BVES，APC，RASSF1A，TIMP3，GSTP1 and HOXA9 promoter methylation could improve the diagnosis of HCC in high-risk population.

Keywords:promoter；methylation；hepatocellular carcinoma

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.009

文章編號：1005-8982（2016）011-0045-05

收稿日期：2016-01-11

*基金項(xiàng)目：浙江省杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃基金（No：2012Z004）

［通信作者］陳岳明，E-mail：hzsylab@163.com