陳海蓮,楊曉娥
(1.山東省菏澤市立醫(yī)院皮膚科,山東菏澤274000;2.山東省曹縣縣立醫(yī)院皮膚科,山東曹縣274400)
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系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞Toll樣受體9和核因子-κB水平的測定及其臨床意義
陳海蓮1,楊曉娥2
(1.山東省菏澤市立醫(yī)院皮膚科,山東菏澤274000;2.山東省曹縣縣立醫(yī)院皮膚科,山東曹縣274400)
摘要:目的測定系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血單個核細胞(PBMCs)Toll樣受體9(TLR9)和核因子-κB(NF-κB)水平并分析其臨床意義。方法選取2013年4月-2014年12月該院風濕免疫科收治的60例SLE患者作為研究對象,其中35例SLE患者處于活動期作為活動組,25例SLE患者處于緩解期作為緩解組。同時選取該院健康體檢者30例作為對照組。對比3組PBMCs中TLR9和NF-κB水平,觀察SLE患者PBMCs 中TLR9、NF-κB水平與臟器受累和免疫抑制劑種類的相關性。結果活動組PBMCs中TLR9水平低于緩解組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);緩解組PBMCs中TLR9水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。活動組PBMCs中NF-κB水平低于緩解組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);緩解組PBMCs中NF-κB水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。皮疹、白細胞降低表現陽性患者與陰性患者PBMCs 中TLR9水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。發(fā)熱、漿膜炎、血尿表現陽性患者與陰性患者PBMCs中TLR9水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。漿膜炎、血尿表現陽性患者與陰性患者PBMCs中NF-κB水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。發(fā)熱、皮疹、白細胞降低表現陽性患者與陰性患者PBMCs中NF-κB水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論SLE患者TLR9水平較正常人群明顯降低,NF-κB水平較正常人群明顯升高,同時TLR9水平的降低與發(fā)熱、漿膜炎、血尿的臨床表現相關。NF-κB水平升高與發(fā)熱、皮疹、白細胞降低的臨床表現相關,嚴密監(jiān)測SLE患者PBMCs中TLR9和NF-κB水平變化對患者的臨床診治有重要價值。
關鍵詞:系統(tǒng)性紅斑狼瘡;外周血單個核細胞;Toll樣受體9;核因子-κB;水平測定;臨床意義
1.1 一般資料
選取2013年4月-2014年12月本院風濕免疫科收治的60例系統(tǒng)系紅斑狼瘡患者作為研究對象。其中,35例SLE患者處于活動期作為活動組,25 例SLE患者處于緩解期作為緩解組。同時,選取本院健康體檢者30例作為對照組。全部患者在本院確診,并簽署知情同意書,本實驗經本院醫(yī)學倫理學會審核?;顒咏M男性4例,女性31例;年齡15~61歲,平均(35.2±9.8)歲;病程2~12年,平均(5.3±2.4)年。緩解組男性3例,女性22例;年齡14~60歲,平均(35.4±8.9)歲;病程3~11年,平均(5.6±2.5)年。對照組男性4例,女性26例;年齡12~61歲,平均(36.3±9.4)歲;病程2~11年,平均(5.1±3.1)年。兩組性別、年齡、病程等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。
1.2 納入標準
①年齡10~65歲;②符合現代內科學第4版關于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷標準;③患者依從度高,可以完成實驗計劃;④臨床資料齊全;⑤告知本研究目的、方法及意義,同意參加并簽署同意書。
1.3 排除標準
①合并強制性脊柱炎、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病;②合并腫瘤、糖尿病、妊娠等。
1.4 實驗方法
有詩云:重重疊疊眾峰開,一脈空谷通宇外;坐堂可覽玉皇頂,莫非天公巧安排 ?人人都知泰山玉皇頂,歷代帝王欣然前往這里筑壇祭天,后來逐漸變成了人們登高望遠、憑眺祖國大好河山的地方。而除了近距離的登臨,如今只需坐在三泰賓館的大堂內,就能遠眺玉皇頂。
1.4.1 分離外周血單個核細胞上午7∶00所有系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及健康體檢者在無菌操作下采集空腹靜脈血5 ml,放置于抗凝試劑管內,與磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)等比例充分混合后搖勻。將5 ml細胞分離液緩慢加入混合液中,在15 cm半徑水平轉子的離心機上以2 000 r/m離心20 min。離心后離心管內液體分為4層,第1層以血清為主,第2層以乳白色單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)為主,第3層是透明分離層,第4層以紅細胞為主。采集第2層液體后加入細胞洗滌液12ml,搖勻后以1500r/min離心10min,舍棄上清液后取沉淀PBMCs得PBMCs懸液。
1.4.2 外周血PBMCs中TLR9水平測定將取得的PBMCs懸液加入到2.5 ml RNase Free的Eppendorf(EP)試劑管內,2 000 r/min離心5 min,加入1.5 ml Trizol液體,室溫靜置3 min,舍棄上清液后加入500 ul異丙醇充分搖勻,加入3.5 ml RNase Free EP管內,將EP管置于冰水混合物上,加入30ul焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)水解RNA沉淀物,30 min后再將EP試劑管加入60℃水浴器中水浴10 min,促使RNA沉淀物充分溶解。依照TLR9基因序列,由上海生共生物工程集團公司合成提供模板RNA。將模板RNA加入RNase Free試劑管,放置于聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀,65℃孵育5 min后冷卻3 min,振蕩搖勻,放置于PCR儀進行逆轉錄反應,反應條件如下:45℃預變性60 min,70℃變性5 min,4℃退火5 h,置入-20℃冰箱冷凍保存cDNA。使用免疫熒光定量測定法依據cDNA測定TLR9水平,cDNA模板在正、反向引物引導下進行反應,最終樣品用美國輝瑞Green Texas分析儀測出TLR9水平。
1.4.3 外周血PBMCs中NF-κB水平測定由上海生共生物工程集團公司提供NF-κB結合的DNA引物,采用寡核苷酸激酶法以r-P-ATP(15 mCi/ml)標記NF-κB探針。在PBMCs溶液中加入3 ml Ficoll溶液,1 800 r/min離心5 min,棄上清液后加入生理鹽水沖洗,加入勻漿緩沖液和核提取液萃取NF-κB結合蛋白,以等量的核蛋白提取液加入r-PATP(標記NF-κB的探針液),搖勻使兩者充分結合,45 g/L聚丙烯凝膠電泳后立即用X放射線顯影,分析NF-κB水平。
1.5 觀察指標
比較3組外周血單個核細胞TLR9和NF-κB水平。分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞TLR9、NF-κB水平與臟器受累和免疫抑制劑種類的相關性。
1.6 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,用t檢驗,計數資料以率表示,用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 一般資料比較
活動組女性比例、年齡、病程與緩解組比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.004、1.542和0.973,P=0.900、0.777和0.936)?;顒咏M女性比例、年齡、病程與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.021、1.790和1.236,P=0.683、0.777和0.647)。緩解組女性比例、年齡、病程與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.241、0.891和1.265,P=0.719、0.771和0.519)。見表1。
表1 3組患者一般資料比較
2.2 3組外周血單個核細胞TLR9水平比較
活動組外周血單個核細胞TLR9水平為(0.52± 0.26),低于緩解組(1.25±0.43)和對照組(2.21± 0.57),差異有統(tǒng)計學意義(t=10.624,P=0.000;t=12.841,P=0.000)。緩解組外周血單個核細胞TLR9水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.397,P=0.025)。
2.3 3組外周血單個核細胞NF-κB水平比較
活動組外周血單個核細胞NF-κB水平低于緩解組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=15.703,P=0.000;t=22.322,P=0.000)。緩解組外周血單個核細胞NF-κB水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=4.770,P=0.034)。
2.4 SLE患者外周血單個核細胞TLR9水平與臟器受累的相關性
皮疹、白細胞降低表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞TLR9水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。發(fā)熱、漿膜炎、血尿表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞TLR9水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 SLE患者臟器受累與外周血單個核細胞TLR9水平的相關性
2.5 SLE患者外周血單個核細胞NF-κB水平與臟器受累的相關性
漿膜炎、血尿表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞NF-κB水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。發(fā)熱、皮疹、白細胞降低表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞NF-κB水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。
表3 SLE患者臟器受累與外周血單個核細胞NF-κB水平的相關性
3.1 SLE與當今TLR9和NF-κB研究成果
SLE是一種免疫相關疾病,發(fā)病過程中細胞免疫、體液免疫紊亂及自身抗體的產生是重要的致病因素[5]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床表現差異很大,多種器官臟器均可受累,一旦病情發(fā)展惡化,最終可出現多器官衰竭而死亡,因此對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制及診斷的研究顯得十分重要。目前,對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷主要以抗核抗體ANA、抗dsDNA抗體等血生化指標為主[6],但是多年的臨床應用結果表明,該檢測效果不能令人滿意。Toll樣受體9是一種固有免疫受體,不僅直接參與抵抗病原微生物的侵襲,同時通過釋放特異的炎癥因子和啟動相應免疫細胞在免疫應答中發(fā)揮重要作用。美國學者CHONG等[7]研究發(fā)現,在狼瘡鼠構建的模型中,TLR9可通過MyD81信號傳導通路活化B細胞的增殖活動,產生dsDNA抗體,刺激抗原提呈細胞表面共刺激受體的過度表達,而當選擇性抑制PBMCs內TLR9表達后,狼瘡鼠體內自身抗體減少,系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀減輕。NF-κB是一種重要的轉錄調控因子[8-10],主要通過與啟動子及增強子的作用,促進多種細胞因子及免疫細胞的活化,在免疫應答早期發(fā)揮至關重要的作用。NF-κB是一種以二聚體形式存在的核因子,由p50和p65兩個亞基組成。NF-κB活化后可進入細胞核內[11-12],調控TNF-β和IL-1的表達。因為TLR9和NF-κB在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中起重要作用,已成為系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究中的熱點。目前,風濕免疫學界對TLR9和NF-κB的研究仍處于較早期的階段,對TLR9和NF-κB在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的確切作用仍不是很了解[13]。
3.2 SLE患者外周血PBMCs中TLR9和NF-κB水平及其與臟器受累的相關性
本實驗結果發(fā)現,SLE活動期患者PBMCs中TLR9水平明顯低于緩解期患者和健康人群,而SLE緩解期患者TLR9水平又明顯低于體檢健康人群,提示外周血PBMCs中TLR9水平在SLE活動期患者最低,正常人群最高,SLE緩解期患者介于兩者之間。而在SLE活動期患者PBMCs中NF-κB水平明顯高于緩解期患者和健康人群,而SLE緩解期患者NF-κB水平又明顯高于體檢健康人群,提示外周血PBMCs中TLR9水平在SLE活動期患者最高,正常人群最低,SLE緩解期患者介于兩者之間[14-15]。在對外周血PBMCs中TLR9、NF-κB與SLE受累臟器的相關性研究中發(fā)現,皮疹、白細胞降低表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞TLR9水平比較,差異無統(tǒng)計學意義;發(fā)熱、漿膜炎、血尿表現陽性患者PBMCs中TLR9水平較陰性患者明顯降低。漿膜炎、血尿表現陽性患者與陰性患者外周血單個核細胞NF-κB水平比較,差異無統(tǒng)計學意義;發(fā)熱、皮疹、白細胞降低表現陽性患者PBMCs中NF-κB水平較陰性患者明顯升高。
綜上所述,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者TLR9水平較正常人群顯著降低,NF-κB水平較正常人群顯著升高。同時TLR9水平的降低與發(fā)熱、漿膜炎、血尿的臨床表現相關,NF-κB水平升高與發(fā)熱、皮疹、白細胞降低的臨床表現相關。嚴密監(jiān)測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞TLR9和NF-κB水平變化對患者的臨床診療有重要價值。
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(童穎丹編輯)
新進展研究
TLR9 and NF-κB levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus and their clinical significance
Ha-lian Chen1,Xiao-e Yang2
(1. Department of Dermatology,Heze Manicipal Hospital,Heze,Shangdong 274000,China;2. Department of Dermatology,Caoxian County Hospital,Caoxian,Shandong 274400,China)
Abstract:Objective To explore and analyze the levels of toll-like receptor 9(TLR9)and nuclear factorκB(NF-κB)in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of patients with systemic lupus erythematosus (SLE)and its clinical significance. Methods Sixty SLE patients in the Department of Rheumatology and Immunology of our hospital from April 2013 to December 2014 were selected as the research objects,including 35 SLE patients in active stage as active group and 25 cases of SLE patients in remission stage as remission group. At the same time,30 healthy cases in our hospital were selected as control group. TLR9 and NF-κB levels in PBMCs were compared between the three groups. The correlations of TLR9 and NF-κB levels inPBMCs with organ involvement and types of immunosuppressants were observed. Results The level of TLR9 in PBMCs of the active group was significantly lower than that of the remission group and the control group (P<0.05). The level of TLR9 in PBMCs of the remission group was significantly lower than that of the control group(P<0.05). The level of NF-κB in PBMCs in the active group was significantly lower than that of the remission group and the control group(P<0.05). The level of NF-κB in PBMCs of the remission group was significantly lower than that of the control group(P<0.05). The TLR9 in PBMCs in the patients with skin rash and decreased white blood cells was not significantly different from that in the patients without skin rash or decreased white blood cells(P>0.05). The TLR9 level in PBMCs of the patients with fever,serositis or hematuria was significantly different from that of the patients without fever,serositis or hematuria(P<0.05). There was no significant difference in the NF-κB level between the patients with and the patients without serositis or hematuria(P>0.05). The level of NF-κB in PBMCs of the patients with serositis or hematuria was not significantly different from that of the patients without serositis or hematuria. The level of NF-κB in PBMCs of the patients with fever,rash or decreased white blood cells was statistically different from that in PBMCs of the patients with negative findings(P<0.05). Conclusions TLR9 level significantly decreases while NF-κB level significantly increases in patients with systemic lupus erythematosus compared to that in normal population. Decreased TLR9 level is correlated with fever,serositis and hematuria. Increased NF-κB level is correlated with fever,rash and reduced white cell count. Close monitoring of TLR9 and NF-κB level changes in PBMCs of system lupus erythematosus patients has important value in clinical diagnosis and treatment of the disease.
Keywords:systemic lupus erythematosus;peripheral blood mononuclear cell;toll-like receptor 9;nuclear factor-κB;clinical significance
中圖分類號:R593.241
文獻標識碼:A
DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.013
文章編號:1005-8982(2016)11-0063-05
收稿日期:2015-05-25