馮宇鵬　朱俊峰　 黃薇　沈艷　葉向東　楊毅*

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科　3)病理科　廣州　51000　2)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科　廣州　51000

Lin28B的高表達(dá)與膀胱癌的惡性程度及預(yù)后相關(guān)

馮宇鵬1)朱俊峰2)黃薇3)沈艷3)葉向東1)楊毅1)*

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科3)病理科廣州510002)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科廣州51000

【摘要】目的探討膀胱癌組織中Lin28B的異常表達(dá)與膀胱癌病理學(xué)分級(jí)、臨床分期及預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Lin28B在75例膀胱癌組織及10例癌旁組織中的表達(dá)；采用卡方檢驗(yàn)或精確概率法分析Lin28B在膀胱癌及癌旁組織中的差異，以及膀胱癌不同病理學(xué)分級(jí)、不同臨床分期中Lin28B的陽(yáng)性率的差異。并采用log-rank檢驗(yàn)及Cox回歸分析Lin28B的表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Lin28B在64%(48/75)膀胱癌組織中表達(dá)陽(yáng)性，在癌旁組織中表達(dá)為陰性(0)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。病理學(xué)分級(jí)惡性程度高的標(biāo)本，Lin28B的陽(yáng)性率高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。臨床分期進(jìn)展程度高的標(biāo)本中，Lin28B的陽(yáng)性率高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。Log-rank檢驗(yàn)及Cox回歸分析示Lin28B表達(dá)陽(yáng)性是預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。結(jié)論Lin28B在膀胱癌中高表達(dá)，且與膀胱癌的病理學(xué)分級(jí)、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Lin28B；膀胱癌；預(yù)后；增殖；轉(zhuǎn)移

隨著腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)和高通量基因組測(cè)序分析技術(shù)的突破性發(fā)展，依靠傳統(tǒng)的大體解剖和顯微鏡下形態(tài)學(xué)診斷的膀胱癌病理學(xué)分級(jí)和臨床分期，已無(wú)法準(zhǔn)確更好評(píng)價(jià)膀胱癌的生物學(xué)行為及判斷預(yù)后[1-2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的關(guān)于膀胱癌診斷及治療的研究著眼于檢測(cè)癌或抑癌基因及其編碼的產(chǎn)物，目的是為了能夠早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌，指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后，監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展，并作為治療的一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，從而提高膀胱癌的治療效果。

全基因組關(guān)聯(lián)測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)MYC和TP63等基因的突變會(huì)大大增加罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。MYC癌基因與Lin28基因的表達(dá)存在互相促進(jìn)的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4]。Subramanian等研究證明在乳腺癌中TP63基因突變通過(guò)上調(diào)Lin28B的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[5]；抑制Lin28B的表達(dá)，TP63突變引起的腫瘤負(fù)荷明顯減弱。國(guó)內(nèi)外目前研究結(jié)果提示，Lin28B是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可能在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、惡性腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)膀胱癌組織中Lin28B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織Lin28B表達(dá)異常升高，且與腫瘤的惡性病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。

1資料與方法

1.1資料收集200-01—2010-12間在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行膀胱鏡活檢或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)或膀胱癌根治術(shù)的75例膀胱癌患者資料。所有膀胱癌組織標(biāo)本來(lái)源于石蠟包塊(包括10例癌旁組織蠟塊)，經(jīng)兩位不同的病理醫(yī)生確診為膀胱癌。膀胱癌的病理學(xué)分級(jí)采用2004年WHO的分級(jí)，分別為低度惡性?xún)A向尿路上皮乳頭狀腫瘤、低級(jí)別和高級(jí)別尿路上皮癌，依次表示為G1、G2、G3。根據(jù)診斷原發(fā)腫瘤時(shí)的B超、胸部X線射片、CT、MR、骨掃描等輔助檢查，以及綜合術(shù)后病理結(jié)果確定膀胱癌的臨床分期?；颊咴\斷為膀胱癌的年齡為(59.99±14.41)歲。隨訪33～89個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為60個(gè)月。

1.2免疫組織化學(xué)方法采用經(jīng)典的辣根過(guò)氧化物酶鏈霉卵白素(SP)免疫組化法。Lin28B蛋白染色陽(yáng)性以細(xì)胞漿為主，極少數(shù)在細(xì)胞核中也有染色。每張切片觀察5個(gè)400倍鏡下視野，綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度0分(陰性)，1分(弱陽(yáng)性)，2分(中等陽(yáng)性)，3分(強(qiáng)陽(yáng)性)；陽(yáng)性細(xì)胞百分率0分(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞)，1分(陽(yáng)性細(xì)胞<25%)，2分(陽(yáng)性細(xì)胞25% ～ 50%)，3分(陽(yáng)性細(xì)胞>50%)，兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和為0～2分者，計(jì)為表達(dá)陰性，>2分者為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或精確概率法分析。采用Kaplan-Meier法估計(jì)生存率，采用log-rank檢驗(yàn)生存曲線的差異，多因素的生存分析采用Cox回歸。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1膀胱癌組織中Lin28B表達(dá)異常75例膀胱癌組織中48例Lin28B表達(dá)呈陽(yáng)性64%，而10例癌旁組織膀胱粘膜中Lin28B表達(dá)均為陰性，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。分析膀胱癌患者病例中Lin28B表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Lin28B在患者年齡、性別等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2膀胱癌組織中Lin28B的表達(dá)與臨床標(biāo)本的病理學(xué)分級(jí)相關(guān)Lin28B在高級(jí)別上皮細(xì)胞癌(低分化)中陽(yáng)性率最高，為78.3%(18/23)；低級(jí)別(中分化)膀胱癌組織中Lin28B的陽(yáng)性率次之，為70.6%(24/34)；低度惡性?xún)A向尿路上皮乳頭狀腫瘤(高分化)陽(yáng)性率最低，為33.3%(6/18)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018) (表1)。

2.3膀胱癌組織中Lin28B的表達(dá)與膀胱癌原發(fā)腫瘤臨床分期相關(guān)如表1，Lin28B的陽(yáng)性率與膀胱癌的浸潤(rùn)程度相關(guān)，從Ta期到T4期依次升高，分別為46.2%、57.1%、66.7%、83.3%、100%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。

2.4生存分析75例膀胱癌病例中，分別對(duì)Lin28B表達(dá)陽(yáng)性與陰性的病例進(jìn)行生存分析，預(yù)期平均生存時(shí)間(月)分別為86.5和62.0個(gè)月，log-rank統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.714，P<0.001，圖1)。進(jìn)一步綜合考慮年齡、性別、病理學(xué)分級(jí)、臨床分期等因素采用Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)Lin28B的表達(dá)，與膀胱癌病理學(xué)分級(jí)、臨床分期相似，也是一種影響膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(RR：0.089，95%CI：0.018 ～ 0.451，P<0.003)。

表1　Lin28B在患者年齡、性別等方面比較

圖1　75例膀胱癌患者Lin28B表達(dá)陽(yáng)性與陰性的

3討論

膀胱癌致病的環(huán)境危險(xiǎn)因素目前研究認(rèn)為包括長(zhǎng)期吸煙，職業(yè)接觸芳香胺和多環(huán)碳?xì)浠衔铮x(chóng)屬的慢性感染，電離輻射暴露和含有非那西丁的止痛藥的濫用。除了環(huán)境因素，基因的重排、擴(kuò)增、和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)改變導(dǎo)致癌基因的激活或抑癌基因的失活在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的作用。Lin28B是一種RNA結(jié)合蛋白，大小約27kDa，主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，也在細(xì)胞核中有少量表達(dá)。Lin28B的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有獨(dú)特的RNA冷休克結(jié)構(gòu)域( cold shock domain，CSD)和一對(duì)反向的CCHC鋅指模體(zinc finger motifs，ZFM)，可與特異RNA結(jié)合，參與基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控，其表達(dá)異常可能參與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、惡性腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[7]。

Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中Lin28B呈高表達(dá)狀態(tài)，且高表達(dá)Lin28B可以促使正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有成瘤作用的肝癌細(xì)胞；在小鼠活體證明敲除Lin28B基因的表達(dá)能夠降低腫瘤的負(fù)荷及延長(zhǎng)壽命,說(shuō)明Lin28B的表達(dá)與肝癌的發(fā)生。Tu等發(fā)現(xiàn)在38%的結(jié)腸癌標(biāo)本中Lin28B表達(dá)異常，且表達(dá)水平越高，腫瘤的增殖速度越快；并在活體動(dòng)物模型中證明Lin28B促進(jìn)腫瘤的形成，沉默Lin28B的表達(dá)能減低腫瘤的負(fù)荷。另外，在卵巢癌和黑色素瘤中也發(fā)現(xiàn)Lin28B表達(dá)上調(diào)，提示Lin28B在惡性腫瘤中表達(dá)水平上調(diào)具有一定的普遍性。在本研究中我們通過(guò)對(duì)75例膀胱癌組織和10例癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)癌旁組織Lin28B表達(dá)均為陰性，而在64%的膀胱癌組織中Lin28B的表達(dá)升高。結(jié)果表明Lin28B表達(dá)升高與膀胱癌的發(fā)生可能有密切的關(guān)系[8-10]。

在哺乳動(dòng)物中Lin28B主要在胚胎干細(xì)胞和發(fā)育中的組織中表達(dá)，即在未分化或低分化的組織細(xì)胞中高表達(dá)。隨著細(xì)胞的分化而表達(dá)水平逐漸降低，至成年個(gè)體中幾乎無(wú)表達(dá)提示Lin28B可能具有維持細(xì)胞分化能力或促進(jìn)細(xì)胞分化。Chien等研究發(fā)現(xiàn)Lin28B在口腔鱗癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中高表達(dá)，且在非干細(xì)胞樣鱗癌細(xì)胞中表達(dá)Lin28B能促進(jìn)干細(xì)胞樣標(biāo)記物OCT4和Sox2的表達(dá)，高表達(dá)Lin28B能夠促進(jìn)正?？谇唤腔掀ぶ匦戮幊虨槎嗄芨杉?xì)14。Chen等研究報(bào)道乳腺癌臨床標(biāo)本中Lin28B的表達(dá)水平與臨床進(jìn)展相關(guān)，與乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)相關(guān)。沉默Lin28B的表達(dá)，乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記分子表達(dá)和特性消失。Alam等研究發(fā)現(xiàn)降低肺小細(xì)胞癌中Lin28B的表達(dá)，能夠降低干細(xì)胞標(biāo)記物HMGA2的表達(dá)，并可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。上述這些研究結(jié)果充分說(shuō)明，Lin28B與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞樣特性密切相關(guān)。惡性腫瘤中病理學(xué)分級(jí)往往代表細(xì)胞的分化程度，也代表腫瘤惡性的侵襲程度，高分化的癌細(xì)胞惡性程度相對(duì)較低，低分化的惡性程度高。本研究發(fā)現(xiàn)Lin28B的表達(dá)在不同病理學(xué)分級(jí)的膀胱癌細(xì)胞中陽(yáng)性率存在差異，在低分化的高級(jí)別膀胱癌中陽(yáng)性率為78.3%，在中分化的低級(jí)別尿路上皮癌中陽(yáng)性率為70.6%，低度惡性?xún)A向尿路上皮乳頭狀腫瘤中陽(yáng)性率最低，為33.3%，癌旁正常膀胱組織為0。另外，本研究分析了Lin28B的表達(dá)與膀胱癌的臨床分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)臨床分期越高(T4)，Lin28B陽(yáng)性率越高，為100%；膀胱癌早期(Ta)，Lin28B陽(yáng)性率最低，為46.2%。進(jìn)一步通過(guò)log-rank檢驗(yàn)和Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)Lin28B的表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后一種獨(dú)立影響因素，結(jié)果顯示Lin28B陽(yáng)性表達(dá)的患者的預(yù)后明顯差于Lin28B表達(dá)陰性的患者?？傊?，Lin28B的表達(dá)上調(diào)與膀胱癌的惡性程度及預(yù)后相關(guān)[11-13]。

此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Lin28與腫瘤治療的療效具有密切的相關(guān)性。Hsu等檢測(cè)104例上皮卵巢癌Lin28B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Lin28B的患者更容易導(dǎo)致化療耐藥；敲除Lin28B的表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑類(lèi)化療藥的敏感性。另外，研究表明高表達(dá)Lin28B與乳腺癌的放療效果不佳有關(guān)，低表達(dá)Lin28B的乳腺癌細(xì)胞株較高表達(dá)Lin28B的乳腺癌細(xì)胞株對(duì)放療更敏感。膀胱癌術(shù)后的輔助治療，常用化療藥物灌注，包括表柔比星、吡柔比星、絲裂霉素、卡介苗、干擾素等等，由于藥物種類(lèi)較多、治療的周期及藥物的用量也存在較大差異，混雜因素較多，因此，本研究未收集Lin28B的表達(dá)對(duì)膀胱癌術(shù)后輔助治療對(duì)預(yù)后的影響。我們將在之后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，詳細(xì)收集膀胱癌術(shù)后輔助藥物治療對(duì)膀胱癌預(yù)后的影響，分析Lin28B的表達(dá)在藥物治療效果的差異性和耐藥性中的作用[14-15]。

總之，Lin28B在膀胱癌組織和正常膀胱粘膜中的差異表達(dá)提示，Lin28B在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。另外，在惡性程度高的膀胱癌中Lin28B表達(dá)明顯高于低度惡性的膀胱癌，且Lin28B表達(dá)上調(diào)的患者預(yù)后明顯差于陰性表達(dá)者，提示Lin28B表達(dá)的檢測(cè)可能成為膀胱癌診斷及預(yù)后有價(jià)值的指標(biāo)，可成為膀胱癌治療的新靶點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

[1]Thomas P, Joseph Paul E, Fine G D, et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer.[J]. Nature, 2014, 515(7528):558-562.

[2]Kamat A M, Flaig T W, H Barton G, et al. Expert consensus document: Consensus statement on best practice management regarding the use of intravesical immunotherapy with BCG for bladder cancer.[J]. Nature Reviews Urology, 2015, 12(4):225-35.

[3]Knowles M A, Hurst C D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.[J]. Nature Reviews Cancer, 2014, 15(1):25-41.

[4]Wang T, Wang G, Hao D, et al. Aberrant regulation of the LIN28A/LIN28B and let-7 loop in human malignant tumors and its effects on the hallmarks of cancer[J]. Molecular Cancer, 2015, 14(1):1-13.

[5]Subramanian M , Francis P ,, Bilke S ,, et al. A mutant p53/let-7i-axis-regulated gene network drives cell migration, invasion and metastasis.[J]. Oncogene, 2015, 34(9):1 094-1 104.

[6]Zhou J, Chng W J, Ng S B. LIN28/LIN28B: An emerging oncogenic driver in cancer stem cells[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2013, 45(5):973-978.

[7]Nguyen L H, Robinton D A, Seligson M T, et al. Lin28b is sufficient to drive liver cancer and necessary for its maintenance in murine models.[J]. Cancer Cell, 2014, 26(2):248-61..

[8]Tu, H.C., et al. LIN28 cooperates with WNT signaling to drive invasive intestinal and colorectal adenocarcinoma in mice and humans. Genes Dev 2015,29(10), 1 074-1 086.

[9]K-F H, M-R S, Y-F H, et al. Overexpression of the RNA-binding proteins Lin28B and IGF2BP3 (IMP3) is associated with chemoresistance and poor disease outcome in ovarian cancer.[J]. British Journal of Cancer, 2015, 113(3):414-24.

[10]Zhenfeng Z, Shengzhe Z, Pengfei M, et al. Lin28B promotes melanoma growth by mediating a microRNA regulatory circuit.[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(9):937-45.

[11]Copley M R, Sonja B, Claudia B, et al. The Lin28b-let-7-Hmga2 axis determines the higher self-renewal potential of fetal haematopoietic stem cells.[J]. Nature Cell Biology, 2013, 15(8):916-925.

[12]Chian-Shiu C, Mong-Lien W, Pen-Yuan C, et al. Lin28B/Let-7 Regulates Expression of Oct4 and Sox2 and Reprograms Oral Squamous Cell Carcinoma Cells to a Stem-like State.[J]. Cancer Research, 2015, 75(12):2 553-2 565.

[13]Chong C, Fengqi C, Lipeng B, et al. IKKβ Enforces a LIN28B/TCF7L2 Positive Feedback Loop That Promotes Cancer Cell Stemness and Metastasis.[J]. Cancer Research, 2015, 75(8):1 725-1 735.

[14]Alam M, Ahmad R, Rajabi H, et al. MUC1-C Induces the LIN28B→LET-7→HMGA2 Axis to Regulate Self-Renewal in NSCLC.[J]. Molecular Cancer Research Mcr, 2015, 13(3):21-28.

[15]Linbo W, Chao Y, Kezhen L, et al. Lin28 mediates radiation resistance of breast cancer cells via regulation of caspase, H2A.X and Let-7 signaling.[J]. Plos One, 2013, 8(6):1 475-1 478.

(收稿2015-12-18)

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212421)；廣州醫(yī)科大學(xué)校級(jí)科研基金資助項(xiàng)目(2013A29)

*通信作者：楊毅，Email：fengyupeng98@163.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R737.14

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1077-8991(2016)03-0012-03