王鵬昊，關(guān)統(tǒng)偉，鄧奧宇，田　蕾，董　丹，趙小林（.西華大學(xué)微生物研究所，四川成都6009；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川成都60；.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川成都65）

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酒曲中高產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的篩選與分子鑒定

王鵬昊1，關(guān)統(tǒng)偉1，鄧奧宇1，田蕾2，董丹1，趙小林3
（1.西華大學(xué)微生物研究所，四川成都610039；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川成都611130；3.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川成都611335）

摘要：白酒酒曲中的蛋白酶和α-淀粉酶在酒類的糖化發(fā)酵過程中起到了重要作用，能夠有效地水解原料，加快發(fā)酵速率。對從酒曲中獲得的30株霉菌進(jìn)行蛋白酶和α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選，結(jié)果表明，產(chǎn)蛋白酶的菌株有15株，占全部測試菌株的50%；產(chǎn)α-淀粉酶的菌株有9株，占全部測試菌株的30%。其中菌株Y27具有最好的蛋白酶活（酶活性為324.72 U/mL）和α-淀粉酶酶活（225.76 U/g干曲）。因此，Y27菌株具有很好的釀酒開發(fā)潛力。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株Y27與Aspergillus oryzae同源性最高，其序列相似性為99.8%。此研究為米曲霉應(yīng)用于釀酒工業(yè)提供了思路。

關(guān)鍵詞：酒曲；霉菌；蛋白酶；α-淀粉酶；米曲霉

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1628.023.html。

酒曲是微生物的培養(yǎng)物，是白酒生產(chǎn)中的糖化劑、發(fā)酵劑、產(chǎn)香劑，有“酒之骨”之稱［1］。釀酒的糖化過程，是酒曲中蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的協(xié)同作用的結(jié)果［2］。其中酒曲中的蛋白酶和α-淀粉酶在釀酒過程中更是起到至關(guān)重要的作用。蛋白酶是分解蛋白質(zhì)肽鍵一類水解酶的總稱。它能有效水解原料中的蛋白質(zhì)，破壞原料顆粒間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使原料中可利用的碳源增加；同時由于蛋白質(zhì)的水解作用，提高了發(fā)酵料中氨基態(tài)氮的含量，促進(jìn)酵母生長繁殖，加快發(fā)酵速率。α-淀粉酶能迅速水解α-1，4葡萄糖苷鍵，將龐大的淀粉分子斷裂成較小分子，使淀粉漿黏度急速降低，生成糊精及少量麥芽糖和低聚糖進(jìn)入下一步的發(fā)酵過程中。所以在白酒生產(chǎn)過程中不能忽視蛋白酶與α-淀粉酶的作用，從酒曲中選育出高產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶的功能優(yōu)質(zhì)霉菌應(yīng)用于釀酒工業(yè)，將極大改善酒曲性能，提高酒的質(zhì)量和產(chǎn)率，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，還可將功能菌應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域，造福人類社會［3-7］。因此，本研究是通過實驗對酒曲中的真菌菌株進(jìn)行分離、篩選與鑒定，希望從中得到產(chǎn)酶活力高的優(yōu)良菌株，為白酒生產(chǎn)提供新的材料。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

從四川瀘州、宜賓、邛崍、大邑等地酒廠的酒曲中分離純化了30株霉菌，分別編號為Y1—Y30，用于蛋白酶和α-淀粉酶的篩選。

Aspergillus oryzae蘇- 16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株由成都蜀之源酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2主要培養(yǎng)基［8］

查氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000mL，pH6.0～6.5。

酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白15 g，Na2HPO42 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩∶水=1∶1（質(zhì)量比），自然pH值。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基：蛋白10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000mL，pH4.0。

固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮8 g，豆餅粉2 g，MgCl20.1%，水10mL。

1.1.3主要試劑與試劑盒

0.4mol/L三氯乙酸：稱取三氯乙酸65.4 g，用水溶解定容至1000mL。

0.5mol/L NaOH溶液：按GB601配制。

1mol/L HCl：取90mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。

0.1mol/L HCl：取9mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。

磷酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02 g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）0.5 g，加水溶解并定容至1000mL。

10 g/L酪素溶液：稱取酪素1.000 g，精確至0.001 g。用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液濕潤后，加入緩沖溶液約80mL。邊加熱邊攪拌，直到完全溶解。冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中。用適宜的pH值緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為3d。

100μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取L-酪氨酸0.1000 g。用60 mL1mol/L鹽酸定容。吸取1 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸定容到100mL。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用。

1.2實驗方法

1.2.1產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

初篩：采用酪蛋白平板水解透明圈法，將分離純化后的菌株點(diǎn)種于酪蛋白培養(yǎng)基平板，于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，挑取產(chǎn)生水解透明圈的菌落，測定L值（L值=透明圈直徑/菌落直徑）后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩：經(jīng)初篩得到產(chǎn)生透明圈的菌株，吸取1mL孢子懸液（108個/mL）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，自然pH值，于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后測定蛋白酶活力。

酶活力測定：取待測酶液。40℃恒溫水浴2min，加入酪素2mL（搖勻），40℃恒溫水浴10min，然后加入三氯乙酸4mL（搖勻），離心取上清液，測OD275nm值。同時作空白對照。對酶活力的規(guī)定：溫度在40℃時，1mL酶液1min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸量，將此定義為1個蛋白酶活力單位。

式中：X——樣品的酶活力（U/mL）；

A——試樣溶液的平均吸光度；

K——吸光常數(shù)；

8——反應(yīng)試劑的總體積（mL）；

2——吸取酶液2.00mL；

1/10——反應(yīng)時間10min，以1min計；

n——稀釋倍數(shù)；

E——中性蛋白酶系數(shù)為0.50。

1.2.2 α-淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選

初篩：把菌株接種到已滅菌的淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)2～3d后，轉(zhuǎn)接入裝有25mL該培養(yǎng)基的液體三角瓶中，以30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h。取1mL培養(yǎng)液用無菌水梯度稀釋，各取0.15mL菌懸液分別涂布于平板分離培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d，在平板上噴灑碘液，將有透明圈的單菌落挑出，進(jìn)一步劃線分離后，挑至斜面保藏培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d，于4℃下保存。

復(fù)篩：取1環(huán)初篩菌種接入種子培養(yǎng)基，于30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h。取1mL接入固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)72h后測定α-淀粉酶酶活，并于4℃下保存活性最佳的菌種。

酶活的測定方法：取底物5mL在40℃水浴預(yù)熱10min，加入0.5mL酶液，準(zhǔn)確保溫5min，取0.5mL混合液加入5mL0.1mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，從中取0.5mL加入5mL稀碘液顯色，在660nm處測定吸光值。以0.5mL緩沖液代替0.5mL的酶液為對照，以蒸餾水作為比色的空白。

酶活力（U/g）=（R0-R）×1000×10/［R0×T×V×（1-β）］

式中：R0、R代表對照和反應(yīng)液的光密度；m為底物中含淀粉的質(zhì)量；T為反應(yīng)時間；V為酶液的體積；β為含水率。

1.2.3菌株產(chǎn)酶酶活穩(wěn)定性研究

α-淀粉酶和蛋白酶的耐酸性研究：配制不同pH值的可溶性淀粉溶液，40℃下分別測定酶活性考察酶的耐酸性。所用的緩沖體系：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH2.2～8.0）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.0～10.0）。

α-淀粉酶和蛋白酶的耐高溫性研究：酶在不同溫度下的失活速率不同，隨溫度的升高，失活速率加快。本實驗在適宜的pH值條件下分別在不同溫度下（30～60℃）測定酶活性，考察酶的耐高溫性。

1.2.4菌株的分子鑒定

（1）霉菌DNA的提取與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增采用真菌試劑盒提取菌株DNA基因組，按照試劑盒說明書操作。真菌試劑盒購自上海生物工程公司。

根據(jù)真菌18S rDNA保守區(qū)設(shè)計引物，上游引物PA：（5'- GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3'）和下游引物PB：（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'），由上海生物工程公司合成。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系（15μL）：樣品DNA 0.6μL、上游引物0.6μL、下游引物0.6μL、2×Master Mix Taq酶7.5μL，無菌重蒸水補(bǔ)足至15μL。采用真菌常規(guī)的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行。

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析［9］

送上海生物工程公司進(jìn)行序列測定，然后用BLAST程序?qū)⑺鶞y的序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析；選擇相應(yīng)參比菌株序列，采用MEGA 6.0軟件及Tamura K等的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［10］。

1.2.5菌株與Aspergillus oryzae蘇-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株性能比較

米曲的制備：取優(yōu)質(zhì)大米淘米2min，浸泡15h，使其含水量在28%～32%。蒸米45min，蒸熟后保持含水量在44%左右。將蒸熟的米滅菌30min，放入無菌室冷卻至31℃，然后按照千分之二的質(zhì)量比接入菌株孢子懸浮液。將接種后的米曲放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)曲溫升至42℃時，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度，使其維持在42℃左右。培養(yǎng)48h后取出烘干備用。該米曲的水分的測定采用烘干法；糖化力的測定采用DNS比色法，即糖化力以1 g絕干曲在pH4.6的條件下，50℃作用1h能糖化可溶解性淀粉的毫克數(shù)表示。液化力的測定采用碘反應(yīng)法，即液化力以1 g絕干曲在pH4.6的條件下，35℃作用1h能液化可溶解性淀粉的克數(shù)表示。酸性蛋白酶測定采用福林法，酸性蛋白酶酶活即在40℃條件下每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果

2.1.1初篩

從30株霉菌中初篩得到產(chǎn)生酪蛋白水解圈菌株共15株，占全部測試菌株的50%。初步測定其L值（見表1），數(shù)據(jù)顯示，其中菌株Y27的L值最大，為3.01。

表1產(chǎn)蛋白酶菌株初篩

2.1.2復(fù)篩及酶活測定

將挑選出L值較大的5株菌，發(fā)酵培養(yǎng)后測定其蛋白酶活性（見表2），5株菌中，L值和酶活都較大的菌株是Y27，分離至濃香型白酒酒曲，其L值為3.01，蛋白酶活是324.72 U/mL。

表2菌株的復(fù)篩

2.2α-淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選

經(jīng)產(chǎn)淀粉酶實驗發(fā)現(xiàn)，共有9株菌產(chǎn)α-淀粉酶，占測試菌株的30%。進(jìn)一步復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，Y8、Y20和Y27產(chǎn)α-淀粉酶活力較好，其中Y27菌株產(chǎn)酶較高，酶活達(dá)到225.76 U/g，其中酶活較低的是Y30菌株，酶活為67.9 U/g，結(jié)果見表3。

表3 α-淀粉酶活性測定結(jié)果

綜合比較供試菌株的產(chǎn)酶能力，則蛋白酶和α-淀粉酶活性最高的是菌株Y27。為了確認(rèn)該菌株是否適合用于酒曲的制備和是否適合酒精發(fā)酵，Y27菌株的耐酸性、耐高溫性研究被進(jìn)一步實施。

2.3Y27菌株產(chǎn)酶酶活穩(wěn)定性研究

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為2.0～9.0，考察蛋白酶和α-淀粉酶的相對活性，結(jié)果見圖1。

圖1酶的耐酸性

圖1表明，α-淀粉酶在pH值為4.0～8.0時可以保持較高的酶活力，其中最高酶活力在pH值為5.5，當(dāng)pH值為4.0時，該酶仍然具有最高活性的70%；當(dāng)pH值為3.0時，α-淀粉酶仍然具有最高活性的45%；說明α-淀粉酶具有一定的耐酸性。對于蛋白酶而言，在pH值為3.0～6.0時保持較好的酶活力，其中pH值調(diào)至4.5時，活性達(dá)到最大；而當(dāng)pH值超過7.0時，蛋白酶相對活性迅速下降至40%左右。表明蛋白酶在酸性條件下酶活穩(wěn)定，能夠發(fā)揮良好的酶解作用。

圖2酶的耐高溫性

在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至最佳的基礎(chǔ)上考察酶的耐高溫性，結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)溫度控制在30～50℃時，蛋白酶可以保持較高的酶活性，其中在40℃時蛋白酶活性最高；當(dāng)溫度升高至50℃時，蛋白酶活性仍為最高值的72%左右，當(dāng)溫度升高至55℃時，蛋白酶活性才降為最高值的60%左右。對于淀粉酶而言，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時，α-淀粉酶活性最高；在30℃時仍可以維持60%的酶活力，當(dāng)溫度升高至60℃時，α-淀粉酶活性才下降明顯。從圖2可以知道，菌株Y27產(chǎn)出的這2種酶對溫度和酸度都有一定的耐受性，表現(xiàn)出較好的適應(yīng)能力，適合白酒的釀造生產(chǎn)。

2.4Y27菌株的鑒定

經(jīng)過序列的Blast比對顯示，菌株Y27屬于曲霉屬的一個種。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），其與Aspergillus oryzae RIB40序列相似性最高，達(dá)到了99.8%，結(jié)合形態(tài)特征，我們確定Y27菌株為米曲霉Aspergillus oryzae RIB40。

圖3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5不同菌株酶系狀況比較分析

Aspergillus oryzae蘇-16是從自然培養(yǎng)麥曲中篩選出的優(yōu)良菌株，用該菌種制成的麥曲來釀造黃酒，有原有黃酒的風(fēng)味特色，因而黃酒行業(yè)普遍使用。Aspergillus oryzae IFO 30113菌株是日本清酒釀造中的常用菌種，將Y27菌株與二者性能比較，可以對Y27菌株的應(yīng)用作進(jìn)一步分析判斷。

采用不同菌株接種的米曲，其比較結(jié)果見表4。

由表4可知，接種Y27菌株孢子懸浮液的米曲其糖化力為1267 mg/g·h，其液化力為2.41 g/g·h，均比Aspergillus oryzae蘇-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株略高，說明Y27菌株對淀粉的利用能力比Aspergillus oryza 蘇-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株更強(qiáng)，適合白酒的釀造生產(chǎn)；其酸性蛋白酶活力（210 U/g）也比Aspergillus oryzae蘇-16（185 U/g）、Aspergillus oryzae IFO 30113（194 U/g）較高，因此具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

3　結(jié)論

蛋白酶和α-淀粉酶在酒類的糖化發(fā)酵過程中起著重要作用，為此對從白酒酒曲中獲得的30株霉菌進(jìn)行篩選，獲得1株高產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶且酶活性能穩(wěn)定的菌株Y27。通過18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Y27與米曲霉（Aspergillus oryzae）在進(jìn)化關(guān)系上同源性最高，達(dá)到了

表4不同菌株酶系狀況比較分析

99.8%。據(jù)統(tǒng)計，至今為止，還沒有關(guān)于米曲霉釀酒的相關(guān)報道，但菌株Y27具備的酶活高且在酸性和高溫條件下的穩(wěn)定為工業(yè)化生產(chǎn)新型白酒提供了獨(dú)特的發(fā)酵菌種資源。這些優(yōu)質(zhì)的菌株有望提高酒的質(zhì)量和產(chǎn)率，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。因此，Y27也是一株具有巨大開發(fā)潛力的工業(yè)菌株，其應(yīng)用前景廣闊。本研究為米曲霉在釀酒行業(yè)的應(yīng)用提供了借鑒，為米曲霉在白酒制曲生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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Screening and Molecular Identification of Fungal Strains with High-Yield of Protease and α-Amylase

WANG Penghao1，GUAN Tongwei1，DENGAoyu1，TIAN Lei2，DONG Dan1and ZHAO Xiaolin3

（1.Research Institute of Microbiology，Xihua University，Chengdu，Sichuan 610039；2.College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130；3.Shuzhiyuan Distillery Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan 611335，China）

Abstract:Protease and α-amylase in liquor starter play important roles in the process of saccharification and fermentation.They could effectively hydrolyze raw materials and accelerate fermenting rate.In this study，30 mold strains isolated from starter underwent protease-producing &α-amylase-producing screening.The results suggested that，there were 15 protease-producing strains，50%of total strains；and there were 9 α-amylase-producing strains，30%of the tested strains.Among them，strain Y27 had the best protease activity（up to 324.72 U/mL）and α-amylase activity（up to 225.76 U/g dry yeast）.Therefore，strain Y27 had good development potentials.Phylogenetic analysis showed that strain Y27 and Aspergillus oryzae had the highest homology with their sequence similarity as 99.8%.This study provided new thoughts for the application of Aspergillus oryzae in liquor-making industry.

Key words:starter；mold；protease；α-amylase；Aspergillus oryzae

中圖分類號：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0061-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015405

基金項目：教育部春暉計劃項目（No.Z2012022）；西華大學(xué)重點(diǎn)科研基金項目（No.Z1220530）；食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實驗室項目（No.Szjj2013-045）和四川省教育廳基金項目（No.13205688）。

收稿日期：2015-10-16修回日期：2016-01-18

通訊作者：關(guān)統(tǒng)偉，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為微生物系統(tǒng)學(xué)與食品發(fā)酵工程。