承德醫(yī)學院病理生理學教研室

李會哲　周曉紅△　靳曉飛　高維娟△(承德 067000)

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實 驗 研 究

黃芪甲苷抑制缺氧缺糖復氧復糖PC12細胞凋亡的研究*

承德醫(yī)學院病理生理學教研室

李會哲周曉紅△靳曉飛高維娟△(承德 067000)

提要目的：研究黃芪甲苷對缺氧缺糖復氧復糖PC12細胞凋亡的抑制作用。方法：取對數(shù)期PC12細胞隨機分為6組：正常對照組(Normal組)、黃芪甲苷溶劑對照組(DMSO組)、模型組(缺氧缺糖復氧復糖組，Model組)、黃芪甲苷高劑量組( AST H組，100 μmol/L)、 黃芪甲苷中劑量組( AST M組，50 μmol/L)、黃芪甲苷低劑量組(AST L組，25 μmol/L)。正常對照組正常培養(yǎng)不進行任何處理；其余各組均進行缺氧缺糖復氧復糖造模：缺氧缺糖4 h后復氧復糖24 h；黃芪甲苷各劑量組和溶劑對照組于造模前0.5 h給藥，直至培養(yǎng)結束。用MTT方法檢測細胞存活率，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果：與正常組相比，模型組細胞折光性差，細胞腫脹簇狀聚集，甚至脫落，細胞之間的突觸消失，細胞本身明顯腫脹，存活率明顯降低，細胞凋亡率增加(P<0.05)。與模型組相比，溶劑對照組和黃芪甲苷低劑量組細胞形態(tài)無明顯變化，存活率和凋亡率差異沒有顯著性(P>0.05)，但黃芪甲苷高、中劑量組細胞腫脹等變化明顯減輕，存活率均增加，細胞凋亡率降低(P<0.05)。黃芪甲苷高劑量組比中、低劑量組細胞存活率高和凋亡率低(P<0.05)。結論：黃芪甲苷可抑制PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖后的損傷和凋亡，其最佳作用濃度是100 μmol/L。

關鍵詞黃芪甲苷；中風；PC12細胞；細胞凋亡；缺氧缺糖復氧復糖；細胞存活率

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率，是危害人們健康的疾病之一。[1]腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病的重要病理過程，其中細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機制中起著關鍵的作用。[2]實驗證實中藥黃芪具有抑制大鼠神經元細胞凋亡、減輕腦缺血再灌注損傷的作用。黃芪甲苷Ⅳ作為其有效活性成分，對腦缺血再灌注損傷有保護作用。[3]筆者通過建立PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖模型，模擬神經細胞缺血再灌注損傷，用黃芪甲苷進行干預，在細胞水平上研究黃芪甲苷對PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖后凋亡的影響，并探討黃芪甲苷的最佳作用濃度，為深入研究黃芪防治腦缺血再灌注損傷的作用機制奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1藥物和細胞：黃芪甲苷購自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%(生產批號：15010913)，PC12細胞由河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院科研中心許順江教授惠贈。

1.1.2試劑和儀器：RPMI1640購自GIBCO公司，青霉素-鏈霉素和0.25%胰酶購于BIOND公司，胎牛血清購自PAR公司，馬血清購自BI公司，無糖EBSS緩沖液購自LEAGENE公司，DMSO購自TCI公司， Annexin/Pl雙染試劑盒：BD公司。倒置顯微鏡DMI3000B型購自徠卡公司，普通培養(yǎng)箱3111型和三氣培養(yǎng)箱3131型購自賽默爾菲公司，超凈工作臺SW-CJ-ID型購自蘇州凈化公司，低速離心機80-2型購自江蘇金壇市金城實驗儀器廠，流式細胞儀FACSAria II型購自BD公司。

1.2方法

1.2.1PC12細胞培養(yǎng)方法： PC12細胞以含10%胎牛血清，5%馬血清，1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液1次，待細胞融合后進行傳代。

1.2.2PC12細胞造模及實驗分組：參照Bossenmyer[4]和Kikuchi k[5]的方法建立缺氧缺糖復氧復糖細胞模型：PC12細胞移除原培養(yǎng)基換用無糖Earle＇s液，隨即把培養(yǎng)瓶放入37℃，94%高純N2，5%CO2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，換正常培養(yǎng)基放入37℃，5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。正常對照組正常培養(yǎng)，不進行任何處理；黃芪甲苷各劑量組和溶劑對照組均于造模前0.5 h給藥，直至培養(yǎng)結束。取對數(shù)期PC12細胞，隨機分為6組：正常對照組(Normal組)、溶劑對照組(DMSO濃度不超過培養(yǎng)基濃度的1‰)、模型組(缺氧缺糖復氧復糖組，Model組)、黃芪甲苷高劑量組(AST H組，100 μmol/L)、中劑量組(AST M組，50 μmol/L)、低劑量組(AST L組，25 μmol/L)。

1.2.3MTT法檢測細胞存活率及細胞的形態(tài)學觀察：將各組細胞以1×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，各組處理同上，復氧復糖培養(yǎng)24 h后，立即在倒置顯微鏡下觀察各組PC12細胞的形態(tài)，隨后將每孔加入MTT(終濃度為5 mg/mL)10 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，之后小心吸棄溶液，注意勿將結晶吸除；每孔加入150 μL DMSO，室溫搖晃震蕩10 min，待沉淀物充分溶解后用酶標儀490 nm處測定各孔吸光度值；細胞存活率以正常組吸光度值的均數(shù)為100%，計算公式如下：

存活率(%)=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%

1.2.4Annexin/Pl雙染鑒定PCI2細胞凋亡：各組細胞懸液的制備，調整細胞密度為1×106/mL，將舊的細胞培養(yǎng)液及胰酶消化后的細胞全部轉移入離心管中，2 000 r/min離心5 min，將凋亡細胞盡量離心下來，棄去培養(yǎng)液，細胞用預冷PBS洗2次，2 000 r/min離心5 min，用100 μL結合緩沖液重懸細胞,加入5 μL Annexin V和5 μL PI混勻后于室溫避光孵育15 min，加入400 μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測分析。

2結果

2.1黃芪甲苷對PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖后存活率的影響與正常對照組相比，模型組細胞存活率明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷高、中劑量組細胞存活率均增加(P<0.05)，但黃芪甲苷低劑量組和溶劑對照組細胞存活率沒有明顯差異(P>0.05)；黃芪甲苷3個劑量組兩兩比較細胞存活率差異均有顯著性(P<0.05)，而高劑量是增加細胞存活率最佳有效劑量。見圖1。

2.2PC12細胞的形態(tài)學觀察正常對照組高分化型PC12細胞為多角形，錐形，細胞有突觸，突觸之間互相連接形成網狀結構，細胞膜完整并且光滑，里面很少的圓形為未分化形且沒有貼壁的細胞，折光性很強。模型組細胞折光性明顯很差，細胞嚴重皺腫脹為圓形并且成簇狀聚集，甚至脫落，細胞之間的突觸消失，細胞本身明顯腫脹。黃芪甲苷高、中劑量組的細胞得到改善并且向正常細胞的狀態(tài)生長。溶劑組和黃芪甲苷低劑量組細胞形態(tài)與模型組相似。見圖2。

圖1　PC12細胞存活率的結果

圖2各組PC12細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)圖(×200)

2.3黃芪甲苷對PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖后凋亡的影響與正常組相比，模型組細胞凋亡率明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組相比，溶劑對照組(即DMSO溶劑組)和黃芪甲苷低劑量組細胞凋亡率差異無顯著性(P>0.05)，但黃芪甲苷高、中劑量組細胞凋亡率均降低，差異具有顯著性(P<0.05)。黃芪甲苷3個劑量組兩兩比較細胞凋亡率差異均有顯著性(P<0.05)，而高劑量是降低細胞凋亡率最佳有效劑量。詳見圖3。

圖3　流式雙染細胞凋亡率結果圖

3討論

缺血性腦血管病是一種能使大腦供血不足，從而導致葡萄糖、氧氣、血清等嚴重缺失，最后造成大腦不可逆損傷的疾病。[6]近年來越來越多的報道指出在腦缺血再灌注損傷中不僅炎癥和細胞壞死起著重要作用，而且細胞凋亡同樣發(fā)揮著舉足輕重的作用。[3]

中醫(yī)理論認為缺血性腦血管病是中風范疇，表現(xiàn)為氣血瘀滯，故需要活血化瘀，疏風通絡。[7]黃芪在《神農本草經》中記載為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，性溫，味甘，具有補氣固表，斂瘡生肌等功效，中醫(yī)學認為其用途廣泛可用于體弱衛(wèi)虛，自汗盜汗及氣虛血瘀，腦卒中后半身不遂等癥狀。[8]黃芪甲苷是黃芪最重要的有效成分之一，可以清除腦缺血再灌注損傷炎癥瀑布所產生的氧自由基，MDA，NF-κB等[9]從而有效的保護神經細胞免受損害。更能抑制腦缺血再灌注損傷中所產生的casepae-3，bax，Junk-3等細胞因子，抑制大鼠神經元細胞凋亡、減輕腦缺血再灌注損傷，[10-13]并且能增加神經細胞的再生功能，[14]從而降低神經細胞的凋亡。

PC12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞中所分化出來的，分化成為3種類型：未分化型，低分化型和高分化型。由神經生長因子所誘導分化出來的PC12細胞與神經元功能相似具有鈣離子通道，電興奮性和神經交感興奮性等性能，又稱類神經元細胞，因此 PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖模型是人們在體外模擬腦缺血再灌注損傷的常用技術手段，它是在研究保護神經元細胞凋亡機制中的首選細胞。[6]

本實驗結果顯示，黃芪甲苷可以提高PC12細胞缺氧缺糖復氧復糖后存活率(P<0.05)，減輕細胞形態(tài)學損傷性變化，抑制細胞凋亡(P<0.05)，其發(fā)揮作用的最佳濃度為100 μmol/L。

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(2016-04-11收稿)

Study on Astragaloside IV Inhibiting PC12 Apoptosis Induced byOxygen-glucose Deprivation and Restoration

Pathophysiology Department, Chengde Medical College

LIHui-zheZHOUXiao-hongJINXiao-feiGAOWei-juan(Chengde 067000)

AbstractObjective: to study the inhibition of Astragaloside IV on PC12 apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation and restoration. Methods: PC12 cells of logarithmic phase were divided randomly into six groups: Normal group, DMSO group (Astragaloside IV solvent), Model group (Oxygen-glucose Deprivation and Restoration), ASTH group (high dose of Astragaloside IV, 100 μmol/L), ASTM group (medium dose, 50 μmol/L), and ASTL group (low dose, 25 μmol/L). Normal group were cultivated normally without any processing, while the others were making models with oxygen-glucose deprivation and restoration: 4 hours’ deprivation before restoring oxygen and glucose for 24 hours; administrations to all dose groups and DMSO group started 0.5 hour before model making and it didn' t stop till the end of cultivation. Cell survival rate was detected with MIT, cell morphology observed under the inverted microscope, and cell apoptosis detected with flow cytometer. Results: compared with normal group, cells of model group had inferior refraction, swelling, clustering even ablating; synapses between cells disappeared, the survival rate significantly decreased and the apoptotic rate increased (P<0.05). Compared with model group, the morphology had no obvious changes in DMSO group and all dose groups, and there was no significant difference in survival rate and apoptotic rate (P>0.05), but in ASTH and ASTM groups, cells were less swelling, the survival rate decreased and the apoptotic rate decreased (P<0.05). Of ASTH group, the survival rate was higher and the apoptotic rate was lower than those of ASTM and ASTL group (P<0.05). Conclusion: Astragaloside IV can inhibit the injury and apoptosis of PC12 induced by oxygen-glucose deprivation and restoration, and the best activity is 100 μmol/L.

Key wordsAstragaloside IV;stroke; PC12; apoptosis; oxygen-glucose deprivation and restoration; cell survival rate

通訊作者：高維娟，女，醫(yī)學博士,教授，博士研究生導師。

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5615(2016)02-0001-04

*河北省應用基礎研究計劃重點項目：No.16967756D； 河北省科技支撐計劃項目：No.13272504D；河北省普通高校高層次人才科學研究計劃項目：No.GCC2014031

△河北中醫(yī)學院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室