河北省辛集市獻血辦公室

張　峰　穆在荷△　王　燁△△　李銀寬△　范國鋒△△△(辛集 052360)

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方 藥 研 究

歸脾湯對支氣管哮喘的抑制作用研究

河北省辛集市獻血辦公室

張峰穆在荷△王燁△△李銀寬△范國鋒△△△(辛集 052360)

提要目的：研究歸脾湯對支氣管哮喘小鼠的治療效果。方法：昆明小鼠60只隨機分為對照組、哮喘組、低劑量歸脾湯治療組(0.5 g/kg)及高劑量歸脾湯治療組(2.0 g/kg)。以30 μg腹腔注射雞卵清蛋白和1%雞卵清蛋白霧化吸入建立慢性哮喘模型。治療組霧化激發(fā)后，連續(xù)5 d給予不同劑量歸脾湯干預(yù)。造模及治療結(jié)束24 h后，檢測各組小鼠經(jīng)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后的呼氣間歇(Penh)值反應(yīng)氣道敏感性；計數(shù)支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞；ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中細胞因子及IgE的濃度；再對支氣管肺組織進行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：與哮喘組相比，低劑量治療組與高劑量治療組的Penh值明顯降低；支氣管肺泡灌洗液中Th2相關(guān)細胞因子(IL-4, IL-5, IL-13)、IgE及嗜酸性粒細胞含量明顯降低(均P<0.05)；治療組肺及支氣管組織中嗜酸性粒細胞明顯減少(均P<0.05)。結(jié)論：歸脾湯對支氣管哮喘具有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞歸脾湯；支氣管哮喘；氣道高反應(yīng)性；支氣管肺泡灌洗液；組織病理學(xué)；變態(tài)反應(yīng)

支氣管哮喘已經(jīng)成為嚴重危害公共健康的疾病，氣道慢性炎癥被認為在該病發(fā)病過程中起著重要作用，[1-3]其主要特點是突發(fā)的氣道高反應(yīng)性(AHR)及以嗜酸性粒細胞為主的炎細胞浸潤，[4-6]Th2淋巴細胞的激活在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。[7]被激活的Th2細胞能產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，[7-8]并引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，[9-12]導(dǎo)致嗜酸性粒細胞的聚集，從而加重哮喘病情。以往的研究證實抑制Th2所釋放的細胞因子可以減輕支氣管炎癥，從而控制哮喘病情。[8]

由人參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、甘草、遠志、酸棗仁、木香、龍眼肉、生姜、大棗等中藥組成的歸脾湯是一種治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的驗方。[13]近年來，常有人報道該方在治療免疫異常疾病方面的案例,[14]但其在減輕哮喘炎癥及癥狀方面的研究鮮有報道，因此本實驗采用歸脾湯對支氣管哮喘進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，歸脾湯可以明顯改善AHR，有效控制慢性炎癥過程。

1資料與方法

1.1實驗動物與藥物無特定病原體級雄性昆明小鼠60只，6～8周齡，購自河北省實驗動物中心[合格證號：1507010]，于室溫(22±2)℃、濕度(55±5)%、12 h 晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。實驗過程符合河北省實驗動物倫理委員會規(guī)定。歸脾湯丸劑購自河北神威藥業(yè)有限公司，并以2 g/mL濃度溶解于25℃的蒸餾水中。

1.2實驗動物模型的制備60只實驗小鼠被隨機分為4組: ⑴ 對照組(10只)以等滲鹽水致敏，實驗期間飼以蒸餾水；⑵ 雞卵清蛋白(OVA)組即哮喘組(10只)先以30 μg OVA胸腔內(nèi)注射致敏，在實驗第36～40天以1% OVA鼻內(nèi)霧化吸入激惹，實驗期間飼以蒸餾水；⑶ 低劑量歸脾湯組(20只)先以O(shè)VA致敏并激惹，在實驗第41～45天以胃管灌入0.5 g/kg的歸脾湯液；⑷ 高劑量歸脾湯組(20只)先以O(shè)VA致敏并激惹，在實驗第41～45天以胃管注入2.0 g/kg的歸脾湯液。

1.3AHR檢測在試驗結(jié)束后24 h，各組小鼠霧化吸入 6.25～50 mg/mL的乙酰甲膽堿以激發(fā)，用無創(chuàng)性小鼠肺功能儀測定不同濃度下增強的呼氣間歇(Penh)值，Penh=(增強呼氣間歇時間)×(PEP/PIP)。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子、IgE及嗜酸性粒細胞的測定在AHR檢測完成后，以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉并處死小鼠，然后以2 mL生理鹽水沖洗肺支氣管3次，收集BALF液，室溫3 000 r/min離心5 min，取上清液送檢驗科以酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定IL-4、IL-5、IL-13及IgE的表達，取沉淀物濕法制片后計數(shù)嗜酸性粒細胞。

1.5肺及氣管組織病理學(xué)檢查分離肺及氣管，10%中性福爾馬林液固定1周，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備層厚5 μm的組織切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)嗜酸性粒細胞。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以均值±標準差的形式表示，以組間比較用Bonferroni方差分析和卡方分析進行統(tǒng)計。

2結(jié)果

2.1歸脾湯對AHR的影響4組小鼠霧化吸入6.25～50 mg/mL 的乙酰甲膽堿后，AHR的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)吸入濃度為0～25 mg/mL時，4組小鼠的penh值差異無顯著性；當(dāng)吸入濃度為50 mg/mL時(最高濃度)，OVA組小鼠的penh值與對照組、低劑量歸脾湯組及高劑量歸脾湯組的差異均有顯著性(P<0.05)，但低劑量歸脾湯組的penh值與高劑量歸脾湯組間差異無顯著性(P>0.05)。提示歸脾湯能明顯抑制卵清白蛋白所誘導(dǎo)的AHR，詳見圖1。

圖1　乙酰甲膽堿吸入后各組間Penh的改變

2.2各組歸脾湯對BALF中Th2細胞因子及IgE的影響比較收集BALF的上清液對Th2細胞釋放的IL-4、IL-5、IL-13及IgE因子進行檢測。與對照組小鼠相比，OVA組的IL-4 、IL-5 、IL-13均明顯高于對照組(均P<0.05)；與OVA組小鼠相比，低、高劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IgE濃度明顯降低，且差異有顯著性(均P<0.05)，低劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-4、IL-5的濃度降低更為明顯，差異有顯著性(P<0.05)；與低劑量歸脾湯組比較，高劑量歸脾湯組小鼠BALF中IL-13及IgE濃度明顯降低，而且差異有顯著性(均P<0.05)，詳見表1。

2.3歸脾湯對BALF中嗜酸性粒細胞的影響取BALF離心沉淀物，濕法制片并進行HE染色，在生物顯微鏡下計數(shù)嗜酸性粒細胞，以嗜酸性粒細胞數(shù)/500BALF細胞表示，結(jié)果顯示OVA組嗜酸性粒細胞百分比為37.9%，明顯高于對照組；而服用歸脾湯后，無論是低劑量組(5.2%)還是高劑量組(18.1%)的嗜酸性粒細胞百分比均明顯低于OVA組，且差異具有顯著性(P<0.05)。

2.4歸脾湯對肺組織內(nèi)嗜酸性粒細胞的影響用生物顯微鏡觀察小鼠肺組織病理切片，隨機選取10個視野計數(shù)浸潤的嗜酸性粒細胞，結(jié)果以每mm2嗜酸性細胞總數(shù)來表示。結(jié)果顯示，OVA組肺組織中嗜酸性粒細胞計數(shù)(51.1±1.2/HPF)明顯高于低劑量歸脾湯組(23.4±2.1)和高劑量歸脾湯組(4.8±2.1/HPF)P<0.05，差異有顯著性。

表1　各組小鼠Th2細胞因子和IgE值 　　 　

注：與對照組比較，*P<0.05；與OVA組比較，#P<0.05；與低劑量歸脾湯組比較,△P<0.05

3討論

支氣管哮喘的發(fā)病機制包括Th2淋巴細胞及其所釋放的細胞因子，還包括發(fā)揮著重要作用的氣道炎癥。當(dāng)患者吸入過敏原后，Th2淋巴細胞通過釋放IL-4、IL-5及IL-13等細胞因子,[15]不僅加強了AHR，而且增加了炎細胞浸潤(如嗜酸性粒細胞)和IgE分泌。[16]筆者研究顯示，哮喘模型鼠中同樣發(fā)生了上述病理改變。此外，有人用Th2細胞因子刺激細胞因子基因敲除小鼠后發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘癥狀明顯加重，[17-18]間接證明上述觀點。筆者實驗證實歸脾湯對哮喘小鼠AHR及Th2細胞因子表達具有藥理學(xué)作用。卵清蛋白致敏的哮喘小鼠AHR明顯增高，IgE以及肺嗜酸性粒細胞表達增加；應(yīng)用歸脾湯后，各項指標均明顯降低，這種改善作用部分依賴于藥物濃度的變化。

IL-5對嗜酸性粒細胞的分化、成熟及存活起著非常重要的作用，能促進嗜酸性粒細胞向炎癥部位的回歸。[10，12]有研究認為IL-5缺失小鼠即便受到抗原刺激也不會產(chǎn)生AHR和嗜酸性粒細胞聚集，[19-20]抗IL-5治療可以明顯降低哮喘小鼠的AHR，減少其體內(nèi)的嗜酸性粒細胞含量。[20-21]臨床研究也證實抗IL-5治療能夠通過改變嗜酸性粒細胞含量，顯著改善一部分重癥哮喘患者的病情。[22-23]本研究顯示，歸脾湯同樣能通過降低BALF和肺組織中的IL-5，達到控制嗜酸性粒細胞增殖的作用。盡管歸脾湯的詳細藥理機制還有待深入研究，但我們的結(jié)果顯示：歸脾湯可以通過降低Th2細胞因子水平及嗜酸性粒細胞數(shù)量來發(fā)揮其抗哮喘作用。

IL-4不僅能夠促進Th2細胞的成熟與分化，還能刺激B細胞分泌IgE。[10，23]反之，抑制IL-4能夠減輕哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細胞的浸潤和IgE的分泌，[24]另有研究顯示IL-4缺失小鼠不會患支氣管哮喘和支氣管炎，[25]提示IgE的產(chǎn)生與IL-4的刺激密切相關(guān)。Th2細胞因子(尤其是IL-4)是支氣管哮喘和嗜酸性粒細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，還有證據(jù)表明嗜酸性粒細胞含量與AHR和哮喘嚴重程度密切相關(guān)。筆者的研究證實歸脾湯能夠有效地減少哮喘小鼠BALF中IgE和IL-4表達，肺的組織病理學(xué)檢查顯示歸脾湯能抑制嗜酸性粒細胞在肺組織中的浸潤。這些結(jié)果均提示歸脾湯能夠通過下調(diào)IL-4而降低支氣管哮喘小鼠的IgE水平，該方劑對IL-4的抑制作用還能夠減輕肺嗜酸性粒細胞浸潤和AHR。

歸脾湯作為一種著名的傳統(tǒng)中藥方劑，被應(yīng)用于臨床已經(jīng)有數(shù)百年的歷史了，其在變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。前人的臨床研究顯示用歸脾湯具有明顯的抗炎作用，可以治療過敏性紫癜、變應(yīng)性鼻炎等免疫性疾病，能夠降低血清中IgE、PGE2、LTC的濃度。[13]它還可以通過抑制CD4+T細胞，降低小鼠血清中IgE水平。[26]與臨床治療結(jié)果相符的是，口服歸脾湯能夠降低I型變態(tài)反應(yīng)小鼠體內(nèi)IgE的產(chǎn)生和組胺的釋放。[27]筆者的實驗結(jié)果表明歸脾湯能降低AHR，減輕哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤，這種治療作用是通過降低Th2細胞因子及IgE來實現(xiàn)的。但是由于中藥方劑中化學(xué)成分極其復(fù)雜，筆者尚不能確認哪一種(些)化學(xué)成分發(fā)揮了上述抗炎作用。

總之，歸脾湯能夠通過降低AHR和氣道嗜酸性粒細胞浸潤而有效控制變態(tài)反應(yīng)性哮喘小鼠的病情，其潛在的藥理學(xué)機制尚需要進一步的研究。

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(2016-01-04收稿)

中圖分類號：R285.6

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5615(2016)02-0042-04

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