董利平，崔玉環(huán)，趙寶民，連晶晶，魏玉磊，顏　娟，鄭茂東，劉占礦

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

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腦缺血/再灌注中柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷介導(dǎo)PARP-1對Th1/Th2平衡的影響

董利平，崔玉環(huán)，趙寶民，連晶晶，魏玉磊，顏娟，鄭茂東，劉占礦

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

[摘要]目的探討大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后給予柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷能否通過調(diào)控二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(PARP-1)影響Th1/Th2細(xì)胞平衡進(jìn)而發(fā)揮腦保護作用。方法將420只大鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組、PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，每組60只。除正常組、假手術(shù)組外，其他組均采用改良Longa線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。術(shù)后2 h，PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組分別給予相應(yīng)藥物腹腔注射，正常組、假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，均1次/d。于干預(yù)后24 h檢測各組缺血腦組織體積，于干預(yù)后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h分別檢測各組缺血腦組織中PARP-1聚合體蛋白表達(dá)量及INF-γ、IL-4含量，計算INF-γ/IL-4比值。結(jié)果各藥物干預(yù)組的缺血腦組織體積均明顯小于模型組(P均<0.05)，柴胡皂苷d+黃芩苷組缺血腦組織體積明顯小于柴胡皂苷d組和黃芩苷組(P均<0.05)；干預(yù)后各時間點模型組PARP-1蛋白表達(dá)量及INF-γ/IL-4比值均明顯高于假手術(shù)組及正常組(P均<0.05)，各藥物干預(yù)組PARP-1蛋白表達(dá)量及INF-γ/IL-4比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，且各時間點柴胡皂苷d+黃芩苷組PARP-1蛋白表達(dá)量及INF-γ/IL-4比值均明顯低于柴胡皂苷d組和黃芩苷組(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黃芩苷組與PJ34組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷可能通過抑制PARP-1表達(dá)，維持Th1/Th2細(xì)胞平衡，從而實現(xiàn)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。

[關(guān)鍵詞]PARP-1；INF-γ/IL-4比值；柴胡皂苷d；黃芩苷；腦缺血再灌注損傷

柴胡皂苷d作為柴胡的主要藥效成分，具有較高的活性，進(jìn)入機體后主要分布在腦、心等組織器官，具有抗腫瘤、抗癌等作用[1]。黃芩苷是黃芩的主要活性成分，是由黃芩素與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合形成的苷類化合物，具有抗氧化、清除氧自由基、抗炎、保護心腦血管及神經(jīng)元等作用[2]。柴胡皂苷和黃芩苷單獨應(yīng)用對腦缺血再灌注損傷具有一定腦保護作用[3]，但柴胡皂苷d和黃芩苷聯(lián)合用藥是否對腦缺血再灌注損傷具有腦保護作用尚不明確。因此本研究探討了大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后給予柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷能否通過調(diào)控二磷酸腺苷核糖多聚酶-1[Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]影響Th1/Th2細(xì)胞平衡進(jìn)而發(fā)揮腦保護作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物與分組健康雄性SD大鼠462只，體質(zhì)量(240±5)g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，動物合格證號：SCXK(京)2006-0008。隨機將大鼠分成正常組、假手術(shù)組、模型組、PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，每組66只。

1.2藥物與試劑黃芩苷(Sigma-Aldrich公司)；柴胡皂苷d(Sigma-Aldrich公司)；PARP-1抑制劑PJ34(美國Santa Cruz公司)；栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司)，試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；大鼠IL-4、INF-γ細(xì)胞因子檢測ELISA試劑盒(Biosource公司)；β-actin及PARP-1聚合體蛋白抗體(北京博奧森公司)。

1.3實驗方法除正常組和假手術(shù)組外，其余組均采用改良Longa線栓法制作右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，缺血2 h后拉出栓線，恢復(fù)血流，造模成功標(biāo)志：右眼Horner征，向左側(cè)傾倒或按逆時針方向轉(zhuǎn)圈，左前肢內(nèi)收屈曲。假手術(shù)組將栓線送至頸內(nèi)動脈但不入顱，2 h后退回頸外動脈。術(shù)后2 h，各組采用腹腔注射每天早晨給藥1次：PJ34組給予PJ34 25 mg/kg，柴胡皂苷d組給予柴胡皂苷d 70 mg/kg，黃芩苷組給予黃芩苷30 mg/kg，柴胡皂苷d+黃芩苷組給予柴胡皂苷d 70 mg/kg和黃芩苷30 mg/kg，正常組、假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1缺血腦組織體積于干預(yù)后24 h，隨機選取各組大鼠6只，快速斷頭取腦組織，等距離切取約2 mm的5個冠狀面腦片，立即放入2%TTC染液，染色30 min，結(jié)果為紅色是正常腦組織，不著色而呈白色為缺血腦組織，并在4%多聚甲醛中避光固定24 h，計算缺血腦組織體積。

1.4.2缺血腦組織中PARP-1聚合體蛋白表達(dá)情況采用Western blot技術(shù)檢測。分別于干預(yù)后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每組各隨機取6只大鼠，冰上取缺血腦組織，提取總蛋白，蛋白定量后，95 ℃水浴變性5 min，每孔上樣200 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜2 h，封閉30 min(5%Blotto液)，加入PARP-1聚合體蛋白一抗(1∶3 000)，4 ℃搖床過夜，TBS-T洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)，搖床孵育1 h，顯色，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白條帶灰度值。

1.4.3缺血腦組織中INF-γ、IL-4含量及INF-γ/IL-4比值分別于干預(yù)后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每組各取6只大鼠，冰上取缺血腦組織，放入研缽中研磨，放入離心管4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液，置-20 ℃冰箱待測。按ELISA試劑盒內(nèi)附說明書測定組織總蛋白溶解液中INF-γ、IL-4含量，計算INF-γ/IL-4比值(以該比值反映Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài))。

2結(jié)果

2.1干預(yù)后24 h各組缺血腦組織體積正常組和假手術(shù)組缺血腦組織體積均為0，模型組為(75.60±3.64)mm3，PJ34組為(55.42±3.71)mm3，柴胡皂苷d組為(65.22±2.38)mm3，黃芩苷組為(67.43±2.79)mm3，柴胡皂苷d+黃芩苷組為(57.09±2.27)mm3。各給藥干預(yù)組缺血腦組織體積均明顯小于模型組(P均<0.05)，柴胡皂苷d+黃芩苷組明顯小于柴胡皂苷d組和黃芩苷組(P均<0.05)。

2.2各組干預(yù)后不同時間點缺血腦組織中PARP-1聚合體蛋白表達(dá)情況干預(yù)后各時間點模型組PARP-1蛋白表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組及正常組(P均<0.05)，并隨缺血再灌注時間延長呈動態(tài)變化，于24 h時達(dá)最高峰；各藥物干預(yù)組PARP-1蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且各時間點柴胡皂苷d+黃芩苷組PARP-1蛋白表達(dá)量明顯低于柴胡皂苷d組和黃芩苷組(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黃芩苷組與PJ34組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；假手術(shù)組和正常組均無明顯變化。見表1。

2.3各組干預(yù)后不同時間點缺血腦組織中INF-γ/IL-4比值及與PARP-1的關(guān)系干預(yù)后各時間點模型組腦組織中INF-γ/IL-4比值明顯高于假手術(shù)組及正常組(P均<0.05)；各藥物干預(yù)組INF-γ/IL-4比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，且各時間點柴胡皂苷d+黃芩苷組INF-γ/IL-4比值明顯低于柴胡皂苷d組和黃芩苷組(P均<0.05)，但柴胡皂苷d+黃芩苷組與PJ34組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；假手術(shù)組和正常對照組均無明顯變化。見表2。

3討論

PARP-1參與腦缺血再灌注的病理過程及其抑制劑的神經(jīng)保護作用在體內(nèi)、外實驗中均得到直接證實[4]。相關(guān)研究顯示，谷氨酸誘導(dǎo)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞可迅速產(chǎn)生PARP-1，給予PARP-1抑制劑PJ34后拮抗了NO產(chǎn)生及谷氨酸所致的細(xì)胞損傷[5]；Goto等[6]報道，在大腦中動脈阻塞(MCAO)模型中，PARP-1-/-小鼠梗死面積的減小是因PARP-1基因缺陷所致，給予PARP-1抑制劑后梗死面積亦減小。

表1　各組干預(yù)后不同時間點缺血腦組織中PARP-1蛋白表達(dá)情況±s)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與柴胡皂苷d+黃芩苷組比較，P<0. 05。

表2　各組干預(yù)后不同時間點缺血腦組織中INF-γ/IL-4比值比較±s)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與柴胡皂苷d+黃芩苷組比較，P<0.05。

在血流再通的早期階段，CD4+T細(xì)胞即參與了缺血再灌注損傷，T細(xì)胞活性被部分激活，可能是通過Th1細(xì)胞分泌某些促炎性因子(IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α等)導(dǎo)致組織損傷[7]，通過Th2細(xì)胞分泌某些抗炎性因子(IL-13、IL-5、IL-10等)保護腦缺血組織[8]。因此認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡與腦缺血再灌注損傷相關(guān)。從理論上講，如果能夠調(diào)節(jié)這種免疫失衡狀態(tài)，就可以減少再灌注損傷，從而改善患者預(yù)后。Laudisi等[9]研究發(fā)現(xiàn)PARP-1在T細(xì)胞激活中發(fā)揮著重要的翻譯調(diào)解作用，并與其參加Th1/Th2平衡密切相關(guān)，PARP-1缺乏可明顯改變免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子及基因的表達(dá)。因而可以推測給予MCAO模型大鼠PARP-1抑制劑還可能通過影響Th1/Th2平衡而改善腦缺血再灌注損傷。

柴胡皂苷d具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤，抑制NF-AT、NF-κB激活的T淋巴細(xì)胞和AP-1信號，對抗增殖，調(diào)解內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)作用[10]。黃芩苷具有抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)作用[11]。本研究證實大鼠短暫局灶性腦缺血再灌注后缺血腦組織中PARP-1蛋白表達(dá)顯著增加，Th1/Th2細(xì)胞失衡，而給予PARP-1 抑制劑PJ34及柴胡皂苷d+黃芩苷干預(yù)后，PARP-1蛋白表達(dá)明顯減少，Th1/Th2失衡顯著改善，但柴胡皂苷d+黃芩苷組與PJ34組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，證實柴胡皂苷d及黃芩苷聯(lián)合給藥可減輕腦缺血再灌注損傷，推測其可能是通過抑制PARP-1表達(dá)，維持Th1/Th2細(xì)胞平衡實現(xiàn)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。

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Effects of Saikosaponin d combined with baicalin on balance of Th1/Th2 in cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting the expression of PARP-1

DONG Liping,CUI Yuhuan, ZHAO Baomin, LIAN Jingjing, WEI Yulei, YAN Juan, ZHENG Maodong, LIU Zhankuang

(The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to study the neuroprotection effects of Saikosaponin d combined with baicalin pretreatment on cell balance of Th1/Th2 in cerebral ischemia-reperfusion injury rats whether by inhibiting the expression of Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1). Methods 420 rats were randomly divided into normal group, sham operation group, model group, PJ34 group, Saikosaponin d group, baicalin group and Saikosaponin d+baicalin group, each group had 60 rats. Cerebral ischemia-reperfusion injury model of rats was made by improved Longa suture method, in 2 h after operation,PJ34 group, Saikosaponin d group, baicalin group and Saikosaponin d+baicalin group were treated with respective drug by intraperitoneal injection once per day, while normal group, sham operation group, model group were given normal saline at the same time. The brain infarct volume were detected after prevention for 24 h, the expression of PARP-1 protein aggregates and INF-γ, IL-4 at different observation time point(after prevention for 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h),INF-γ/IL-4 was calculated. Results Compare to model group, the infarct volume in every treatment group was significantly smaller(P<0.05), while the volume of combination group was smaller than that in Saikosaponin d group, baicalin group (P<0.05).At every time point after prevention, the expression of PARP-1 and INF-γ/IL-4 in model group were all higher than that in normal group and sham operation group (P<0.05), and the indexes above in every treatment group were lower than that in model group (P<0.05), and at every time point, the indexes in combination group were lower than that in Saikosaponin d group, baicalin group (P<0.05), no significant difference was found between Saikosaponin d group and baicalin group (P>0.05). Conclusion Saikosaponin d combined with Baicalin has certain neuroprotection effects in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury, which probably implemented by inhibiting PARP-1 expression and maintaining the cell balance of Th1/Th2．

Key words:PARP-1; INF-γ/IL-4; Saikosaponin d; baicalin; cerebral ischemia-reperfusion injury

[作者簡介]董利平，女，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。 [通信作者]劉占礦，E-mail:lzk@163.com

[基金項目]河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(ZL20140035)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.005

[中圖分類號]R743.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)19-2066-04

[收稿日期]2016-01-25