黃群蓮，王利國(guó)，唐　燦，黃　易，黃愛(ài)玲，孫　琳

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

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藥物研究

HPLC梯度洗脫同步測(cè)定瀘州產(chǎn)梔子主要有效成分梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的含量

黃群蓮1，王利國(guó)2，唐燦3，黃易3，黃愛(ài)玲3，孫琳3

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

[摘要]目的建立HPLC梯度洗脫同步測(cè)定瀘州產(chǎn)梔子中梔子苷和西紅花苷-Ⅰ含量的測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，使用20RBAX SB-C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min，流速1 mL/min，變波長(zhǎng)檢測(cè):0～30 min，238 nm，30～60 min，440 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果瀘州產(chǎn)梔子中梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在31.7 mg/g以上，西紅花苷-Ⅰ均在5.58 mg/g以上。梔子苷的積分面積A與進(jìn)樣量M線性回歸方程為A=1 963.231M+9.151 108(r2=0.999 991)，進(jìn)樣量在0.132 5～10.6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。西紅花苷-Ⅰ積分面積A與進(jìn)樣M線性回歸方程A=4 539.579M+14.504 24(r2=0.999 991)，進(jìn)樣量在0.021～1.68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)論該方法分離良好，測(cè)定準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可同時(shí)測(cè)定梔子中梔子苷和西紅花苷-Ⅰ兩種有效成分,為全面控制瀘州產(chǎn)梔子質(zhì)量提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]梔子;梔子苷;西紅花苷-Ⅰ;高效液相色譜;梯度洗脫

瀘州地理位置優(yōu)越，氣候溫和，四季分明，氣候適宜作物生長(zhǎng)[1-2]，中藥材極為豐富，是四川省重點(diǎn)藥材產(chǎn)區(qū)之一，素有“藥材之鄉(xiāng)”的美稱。中藥材資源主要品種有趕黃草、黃梔子、石斛、青果、青蒿、黃柏、杜仲、天麻等[3]。 梔子(Gardenia jasminoides Eillis)見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是茜草科(Rubiacece)梔子屬(Gardenia)的一種常綠灌木的果實(shí)，具有清熱除煩、涼血解毒之功效，是生產(chǎn)“清開(kāi)靈”“安宮牛黃丸”“龍膽瀉肝丸”“清熱解毒顆?！盵4]“茵梔黃注射液”等中成藥的重要原料。國(guó)內(nèi)梔子藥材資源豐富，但多數(shù)為野生資源，缺乏規(guī)范的管理[5]。目前市場(chǎng)上流通的梔子藥材，因受產(chǎn)地來(lái)源、采收時(shí)間、儲(chǔ)藏時(shí)間及基原植物的影響，質(zhì)量參差不齊。在梔子藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)中，2010年版《中國(guó)藥典》一部?jī)H規(guī)定了測(cè)定梔子苷的含量，然而梔子苷并非梔子藥材的唯一有效成分[6]。梔子在醫(yī)療、保健、食品等方面應(yīng)用較廣，因此僅將梔子苷作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的唯一指標(biāo)顯然不夠，還應(yīng)將具有顯著藥理作用及應(yīng)用價(jià)值的色素類成分如西紅花苷-Ⅰ也列為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。而通過(guò)測(cè)定瀘州產(chǎn)梔子主要有效成分梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的含量,能指導(dǎo)藥農(nóng)科學(xué)種植梔子，提高瀘州產(chǎn)梔子藥材的品質(zhì)和規(guī)模，形成規(guī)范化大規(guī)模梔子GAP種植基地，為地方中藥企業(yè)提供優(yōu)質(zhì)梔子原藥材，促進(jìn)瀘州經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1試驗(yàn)材料與儀器

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)藥材野生及個(gè)體戶種植的梔子，采自瀘州納溪區(qū)和龍馬潭區(qū)，經(jīng)課題組鑒定均為茜草科植物梔子(Gardenia gasminoides Ellis)和水梔子(G.jaminoides Ellis.f.logica-rpa Z.W. Xie et OKada)的干燥成熟果實(shí)。采集后進(jìn)行干燥，研磨成粗粉，備用。

1.1.2藥品與試劑梔子苷(供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，約20 mg,批號(hào) ：110742-200516);西紅花苷-I(供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，約20 mg,批號(hào):111588-00501);乙腈(色譜純，上海星可生化有限公司);甲醇(分析醇，四川西隴化工有限公司);80%甲醇:量取甲醇160 mL,蒸餾水40 mL,配制成80%甲醇200 mL;蒸餾水(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科);無(wú)水乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司)。

1.2試驗(yàn)儀器高效液相色譜儀(型號(hào)為Agilent Q60);20RBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,Agilent Technologies);電子天平(FA1104N型,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);超聲震蕩儀(AS2060B型,天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。2 mL透明帶刻度螺旋口樣品瓶,11.6×32 mm,5.0玻璃(適合安捷倫HPLC);紅色特氟龍/白色硅膠隔墊，Φ9 mm×1 mm;藍(lán)色開(kāi)口聚丙烯蓋，Φ9 mm,中心孔徑6 mm;GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);T-50砂芯過(guò)濾裝置抽濾裝置(1 000 mL)天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);一次性針頭式濾器水系混合纖維素膜25 mm×0.22 μm；微孔濾膜水系濾膜(Ф50 mm×3 μm,50片/盒,上海新亞有限公司)。

2試驗(yàn)方法

2.1預(yù)前處理

2.1.1樣品的處理將采集到的梔子逐一先按產(chǎn)地，再按紅果、黃果、綠果進(jìn)行分類。將分類好的梔子豎切成兩半，放入烘干箱中調(diào)至50 ℃進(jìn)行烘干[7]。記錄樣品編號(hào)如表1。

表1　梔子樣品來(lái)源

2.1.2供試品溶液的制備取干燥后的梔子用鐵研錘進(jìn)行研磨，過(guò)16號(hào)篩。分別稱取各地待測(cè)梔子樣品，粉末質(zhì)量見(jiàn)表2。將稱取好的梔子粉末，分別置于150 mL錐形瓶中，用移液管精密加入80%甲醇40 mL超聲2 h。將錐形瓶拿出來(lái)放涼，搖勻，放置，然后用漏斗過(guò)濾，得到供試品溶液。用翻口瓶進(jìn)行密封，放于冰箱冷藏室中保存，并貼好標(biāo)簽。取適量供試品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得待試溶液。

表2　各地梔子稱取質(zhì)量

2.1.3對(duì)照品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品5.3 mg,置于5 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得1.06 mg/mL梔子苷對(duì)照品；精密稱取西紅花苷-I對(duì)照品4.20 mg,置于25 mL量瓶中，用80%甲醇溶解定容至刻度，即得0.168 mg/mL西紅花苷-I對(duì)照品溶液[8]。

2.2色譜條件色譜柱：20RBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相：乙腈-水溶液，梯度洗脫：0 min→18 min→20 min→40 min→50 min→55 min,乙腈10%→18%→28%→38%→50%→10%;檢測(cè)波長(zhǎng)：0～30 min,238 nm,30～60 min,440 nm;柱溫35 ℃；流速1 mL/min;進(jìn)樣量5 μL[9]。

2.3色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以梔子苷、西紅花苷-Ⅰ峰計(jì)算，測(cè)得理論塔板數(shù)分別為28 765，724 792。梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和前后的色譜峰達(dá)到基線分離,對(duì)稱因子分別為0.67，0.68，峰形基本對(duì)稱。在測(cè)定時(shí)比較穩(wěn)定，峰面積也較大，因此二者可以選作參照物峰。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1　梔子苷對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2　西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品HPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考察精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.6 mg置于10 mL容量瓶中,加80%甲醇至刻度，精密量取5 mL梔子苷對(duì)照品溶液，5 mL西紅花苷對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中備用。對(duì)照品溶液進(jìn)樣量:濃度不變，雙重進(jìn)樣時(shí)依次按0.3,0.5,1,2,5,8,16,20 μL分別注入液相色譜儀，按 2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。以對(duì)照品進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。梔子苷積分面積A與進(jìn)樣量M線性回歸方程:A=1 963.231M+9.151 108,r2=0.999 991,進(jìn)樣量在0.132 5～10.6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見(jiàn)圖3。西紅花苷-Ⅰ積分面積A與進(jìn)樣量M線性回歸方程：A=4 539.579M+14.504 24，r2=0.999 991，進(jìn)樣量在0.021～1.68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖4。

3結(jié)果

對(duì)照品以及各地采集的梔子供試品HPLC圖譜見(jiàn)圖5～13。根據(jù)供試品HPLC圖譜峰面積計(jì)算各得測(cè)品含量，結(jié)果見(jiàn)表4及表5。

4討論

《中國(guó)藥典》2010版一部載有梔子苷HPLC含量測(cè)定方法。梔子苷的含量是藥用梔子優(yōu)選中的一個(gè)很重要的指標(biāo)，但現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，中藥材是個(gè)復(fù)雜體系，僅將梔子苷作為梔子的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)是不夠的，很有必要將其中具有顯著抗炎活性的有機(jī)酸類物質(zhì)及具有明顯降血脂及抗腫瘤作用的西紅花苷類的測(cè)定作為梔子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[10]。

表3　線性關(guān)系考察結(jié)果

圖3　梔子苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖4　西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖5　NX1樣品圖HPLC色譜圖

圖6　NX2樣品HPLC色譜圖

圖7　NX3樣品HPLC色譜圖

圖8　NX6樣品HPLC色譜圖

圖9　NX7樣品HPLC色譜圖

圖10　QL1樣品HPLC色譜圖

圖11　QL4樣品HPLC色譜圖

圖12　QL5樣品HPLC色譜圖

圖13　BZ3樣品HPLC色譜圖表4　西紅花苷-I的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

編號(hào)藥材質(zhì)量/g西紅花苷-Ⅰ面積西紅花苷-Ⅰ進(jìn)樣量/μg西紅花苷-Ⅰ濃度/(μg/μL)西紅花苷-Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg/g)NX15.046411270.70.88980.17807.0526NX25.000412292.10.97050.19417.7630NX35.016310542.00.83220.16646.6356NX65.076512040.00.95060.19017.4899NX75.055011894.80.93910.18787.4309QL15.004513814.71.09080.21828.7189QL45.031012690.71.00200.20047.9666QL55.07298972.30.70810.14165.5832BZ30.943613524.61.06790.21369.0539

表5　梔子苷的檢測(cè)結(jié)果

梔子黃色素的主要成分為以西紅花苷-Ⅰ為主的西紅花苷類成分，具有利膽、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[11]。在試驗(yàn)過(guò)程中，西紅花苷-I的重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)出的結(jié)果差異較大。經(jīng)分析，可能是因?yàn)樵囼?yàn)過(guò)程中沒(méi)有注意避光保存，樣品在日光照射下發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)注意取樣后及時(shí)將其避光保存。此外，在本次試驗(yàn)中梔子超聲震蕩提取前未進(jìn)行浸泡，可能會(huì)降低提取的有效成分含量。

從本研究結(jié)果可知，NX3、QL5這兩個(gè)綠果期的西紅花苷-Ⅰ含量比其他的樣品低，而梔子苷的含量比較高。而紅熟期梔子NX6、QL1、BZ3梔子苷峰面積依次下降，此時(shí)西紅花苷-Ⅰ含量均比黃果和青果時(shí)期的含量高。

山梔子是傳統(tǒng)中藥，有瀉火除煩、涼血散瘀的功效，在臨床中應(yīng)用甚廣。水梔子主要作為工業(yè)和食品的黃色天然著色原料。兩者所含的環(huán)烯醚萜苷類成分之一梔子苷(geniposide)為有效成分，水梔子果實(shí)大，產(chǎn)量高，易于栽培管理[12]。通過(guò)測(cè)定和比較二者所含梔子苷的不同，可以推斷水梔子是否能作為一種傳統(tǒng)中藥材的代用品。

本試驗(yàn)中提取后的樣品溶液雖放入翻口瓶中密封，并置于冰箱中冷藏保存。但由于試驗(yàn)的時(shí)間較長(zhǎng)，瓶中溶液出現(xiàn)了不同程度的結(jié)晶。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，由于梔子黃色素在冷藏過(guò)程中容易產(chǎn)生沉淀。其產(chǎn)生沉淀的原因主要是2價(jià)和3價(jià)金屬離子特別是Ca2+的存在容易引起溶液中部分成分的聚沉[12]。在本次試驗(yàn)中采用的處理方法是用超聲震蕩儀進(jìn)行短時(shí)間的震蕩以除去沉淀，肉眼見(jiàn)均一的澄清溶液。

試驗(yàn)中使用的梯度洗脫方法是參照王子雯等[9]2013年發(fā)表的“巴中產(chǎn)梔子不同采收期指紋圖譜的比較研究”所實(shí)踐過(guò)的方法。但在試驗(yàn)過(guò)程中，幾次出現(xiàn)柱壓過(guò)高導(dǎo)致的儀器停止運(yùn)行的情況，可能是儀器老化導(dǎo)致，或是因?yàn)檫^(guò)濾系統(tǒng)的清洗不夠徹底。本研究中嘗試將常用型號(hào)的0.45 μm過(guò)濾頭換成了0.22 μm的過(guò)濾頭，增加預(yù)柱以排除干擾。

文中建立的RP-HPLC法，利用紫外檢測(cè)器，通過(guò)HPLC 系統(tǒng)中的操作軟件進(jìn)行程序設(shè)定，采用變波長(zhǎng)、梯度洗脫的方法，在同一色譜條件下能夠同時(shí)檢測(cè)梔子中的梔子苷類和西紅花苷-Ⅰ成分，由HPLC圖譜可看出供試品中各組分與其他組分均能達(dá)到基線分離，且基線平穩(wěn)。該方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，比現(xiàn)行藥典方法更能全面客觀地反映梔子藥材質(zhì)量，在梔子內(nèi)在成分含量測(cè)定上具有一定的創(chuàng)新性，可為提高梔子質(zhì)量控制方法提供參考。

該地梔子藥材梔子苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在31.7 mg/g以上，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.5 mg/g，說(shuō)明瀘州地區(qū)梔子藥材所含化學(xué)成分隨產(chǎn)地的變化小，產(chǎn)區(qū)梔子質(zhì)量?jī)?yōu)良。梔子苷含量均高于藥典的要求(18 mg/g)，符合國(guó)家藥用標(biāo)準(zhǔn)。

西紅花苷-Ⅰ濃度最低為5.6 mg/g, 最高達(dá)9.1 mg/g, 含量相差近一倍。作為提取西紅花苷類色素的原料,同一產(chǎn)區(qū)的梔子也應(yīng)有所選擇。梔子苷與西紅花苷-Ⅰ含量無(wú)明顯關(guān)系。

經(jīng)本研究數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以看出，以梔子提取梔子苷入藥，則以青果期梔子為佳。但若要提取西紅花苷-I或主要以西紅花苷-I入藥，則以紅熟期梔子更好[14]。

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[通信作者]唐燦，E-mail：Tang9670625@163.com

[基金項(xiàng)目]四川省科技廳聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目(14ZC0045)；瀘州市政府聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目(2013LZLY-K69)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011SZ0048)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010SZ0049)；四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2005A071)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.035

[中圖分類號(hào)]R965.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)19-2148-05

[收稿日期]2015-12-15