張鑒　袁崎　傅茂英

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·論著·

SHIP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

張鑒袁崎傅茂英

215300江蘇省昆山市，江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院綜合外科

【摘要】目的研究SHIP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),探討其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后之間的關(guān)系。方法應(yīng)用qPCR和免疫組織化學(xué)方法(IHC)分析SHIP2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)。使用Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)方法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型來(lái)進(jìn)行生存分析，評(píng)估100例非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后。結(jié)果SHIP2在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織(P<0.05)。SHIP2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042),TNM階段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)有關(guān)。Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)方法和時(shí)序檢驗(yàn)分析進(jìn)一步表明SHIP2高表達(dá)、吸煙、晚期腫瘤和預(yù)后不良顯著相關(guān)。結(jié)論SHIP2表達(dá)和非小細(xì)胞肺癌的惡性表型相關(guān)，可以作為非小細(xì)胞肺癌獨(dú)立預(yù)后因素和重要致癌基因。

【關(guān)鍵詞】SHIP2；非小細(xì)胞肺癌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

肺癌是全球常見(jiàn)、致命的惡性腫瘤[1,2]。在我國(guó), 過(guò)去的三十年肺癌的病死率增加了400%,是第二大死因[3]。肺癌包括小細(xì)胞肺癌(SC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，后者約占85%。早期NSCLC患者術(shù)后的長(zhǎng)期生存率較高。然而,大多數(shù)的NSCLC患者(占80%)診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期。盡管NSCLC診斷和治療技術(shù)不斷改善,但患者的預(yù)后仍然很差,5年生存率仍然較低(15%)[4,5]。目前,研究人員正在關(guān)注與NSCLC預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物[6,7]。尋找與預(yù)后因素相關(guān)的重要基因，以期能夠增加潛在治療靶點(diǎn)的選擇和對(duì)NSCLC的治療。SHIP2被認(rèn)為下調(diào)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào),導(dǎo)致了多種人類癌癥的進(jìn)展[8-10]。最近的兩項(xiàng)研究表明,SHIP2有致瘤的特征, SHIP2高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后和喉鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)(LSCC)[11,12]。這些發(fā)現(xiàn)表明,在腫瘤發(fā)生中SHIP2扮演關(guān)鍵角色。因此,SHIP2可能是人類癌癥候選生物標(biāo)志物，對(duì)預(yù)后有著預(yù)測(cè)作用。然而, NSCLC SHIP2的表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性的實(shí)質(zhì)性的作用機(jī)制尚未闡明。本研究中，我們選擇SHIP2作為研究對(duì)象，運(yùn)用qPCR和免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測(cè)NSCLC中SHIP2含量及相應(yīng)表達(dá)情況，并根據(jù)組織芯片(TMA)建立的非小細(xì)胞肺癌患者數(shù)據(jù)庫(kù)，分析SHIP2與NSCLC臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料100例甲醛固定,石蠟包埋的NSCLC腫瘤(其中肺腺癌45%,肺鱗癌55%)標(biāo)本來(lái)源于2005至2006年我院患者?；颊吣挲g35～81歲，平均年齡(手術(shù)時(shí))(60.4±2.8)歲。收集相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),包括性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型、吸煙狀況、腫瘤分化,TNM階段,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,5年隨訪生存。患者術(shù)前均未接受放療、化療、或免疫療法。16例新鮮冷凍NSCLC腫瘤標(biāo)本(8例腺癌和8例鱗癌)和相鄰瘤旁組織樣本來(lái)源于我院。

1.2qPCR檢測(cè)分析采用Trizol試劑(Life Technologies公司, 格蘭德艾蘭, 紐約)從16例新鮮NSCLC組織以及相應(yīng)的癌旁組織中細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明書進(jìn)行qPCR檢測(cè)分析。SHIP2的引物如下:正向引物5’-TCGTCACCAGCGACCATT C-3’;反向引物5’-AGCCCTTTCTTGGAGATGAACTG-3’。內(nèi)參GAPDH引物如下:正向引物5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向引物3’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-5’。

1.3組織芯片制作TMA由上海芯超生物公司定制。TMA被切成4 μm大小，使用多克隆山羊抗SHIP2抗體(Santa Cruz Biotechnology公司,圣克魯斯,加州,美國(guó))在全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)(LabVision公司,卡拉馬祖，密歇根州，美國(guó))下分別染色。二抗使用山羊抗辣根過(guò)氧化物酶HRP抗體(Dako Cytomation公司，卡平特里亞，加州，美國(guó))。IHC結(jié)果分析按照既往IHC分析方法進(jìn)行分析[13,14]。SHIP2免疫組化染色評(píng)分(HIS)由2個(gè)獨(dú)立的病理學(xué)專家根據(jù)染色強(qiáng)度和SHIP2陽(yáng)性細(xì)胞的百分比得出。每個(gè)切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野,使用免疫組織化學(xué)評(píng)分(IHS)方法來(lái)評(píng)估陽(yáng)性染色百分比。IHS通過(guò)評(píng)估染色密度和強(qiáng)度分析結(jié)果，染色強(qiáng)度評(píng)分：0(陰性)，1(弱陽(yáng)性)，2(陽(yáng)性)，3(強(qiáng)陽(yáng)性)。SHIP2陽(yáng)性細(xì)胞百分率也根據(jù)以下評(píng)分分為四類：1代表0～10%，2代表11%～50%，3代表51%～80%，4代表81%～100%。兩者分?jǐn)?shù)之和得出最終的HIS分值：總分低于3的樣本(IHS≤3)被認(rèn)為是SHIP2低表達(dá)，為陰性表達(dá)。而以總分4以上(IHS≥4)為SHIP2高表達(dá)，為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用STATA 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，新鮮NSCLC組織與癌旁正常組織SHIP2 mRNA表達(dá)比較應(yīng)用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)預(yù)后重要因素進(jìn)行單變量和多變量分析。SHIP2表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后之間關(guān)系使用Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1應(yīng)用qPCR檢測(cè)NSCLC組織標(biāo)本中SHIP2 mRNA的表達(dá)檢測(cè)提取自16例新鮮NSCLC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織的總RNA中SHIP2 mRNA表達(dá)。SHIP2 mRNA在NSCLC組織中(4.34±0.133)的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織(2.12±0.064) (P<0.05)(以GAPDH作為蛋白質(zhì)內(nèi)參), SHIP2在非小細(xì)胞肺癌樣本的表達(dá)比相應(yīng)的癌旁正常組織高出約2.05倍。見(jiàn)圖1。

2.2SHIP2表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的聯(lián)系SHIP2的高表達(dá)是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042),TNM階段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)相關(guān)。SHIP2與其他參數(shù),如性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、吸煙狀態(tài)和腫瘤分化無(wú)明確相關(guān)性。見(jiàn)表1。

圖1SHIP2 mRNA在16例新鮮NSCLC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織的表達(dá)

表1　SHIP2高表達(dá)與NSCLC臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

2.3應(yīng)用免疫組化法(IHC)檢測(cè)NSCLC TMA中SHIP2表達(dá)觀察到在NSCLC 中SHIP2有高表達(dá) 55(55.0%)。對(duì)照組腫瘤癌旁肺組織樣本相比只有16(16.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.4生存分析對(duì)所有相關(guān)因素使用Cox回歸模型進(jìn)行單變量分析, SHIP2的高表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，可以作為NSCLC預(yù)后因子。吸煙狀態(tài)(P=0.035)和腫瘤TNM階段(P=0.047)也與患者的存活率密切相關(guān)。在Cox回歸模型中的多變量分析證明SHIP2表達(dá)(P=0.001),吸煙狀態(tài)(P=0.009),與腫瘤TNM階段(P=0.009)是生存最重要的預(yù)測(cè)因子。Kaplan-Meier生存曲線表明, NSCLC患者SHIP2的低表達(dá)、不吸煙、早期的TNM階段明顯有利于延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。見(jiàn)表2，圖3。

圖2SHIP2蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織TMA中IHC染色的表達(dá)

注：A1.癌旁陰性(免疫組化×40)；A2.癌旁陰性(免疫組化×400)；B1.NSCLC陽(yáng)性(免疫組化×40)；B2.NSCLC陽(yáng)性(免疫組化×400)；C1.癌旁陽(yáng)性(免疫組化×40)；C2.癌旁陽(yáng)性(免疫組化×400)

表2　NSCLC 5年生存預(yù)后因素的單變量和多變量分析

圖3　100例NSCLC患者應(yīng)用kaplan meier生存分析

3討論

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (P13K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞生存重要通路之一，它的異常改變是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特性，細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過(guò)啟動(dòng)P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡。P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞惡性增殖、血管新生和轉(zhuǎn)移以及對(duì)放化療的拮抗中起著重要作用。目前認(rèn)為脂質(zhì)磷酸酶SHIP蛋白的研究具有重要的地位。含有肌醇環(huán)5’磷酸酶的SH2結(jié)構(gòu)域(SH2 domain-containing inositol 5’-phosphatase，SHIP)有SHIP1和SHIP2兩種同源物, N端為SH2結(jié)構(gòu)域；中間部位為磷脂酰肌醇5`磷酸酶的催化中心，酪氨酸的磷酸化是活化的表現(xiàn)；SHIP的C端為富含脯氨酸的區(qū)域。長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為SHIP1和SHIP2通過(guò)抵消P13K/Akt信號(hào)通路途徑來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。它通過(guò)其5’磷酸酶特異性水解PI(3、4、5)P(3)生成PI(3、4)P(2)，負(fù)向調(diào)節(jié)PI3-K活性，導(dǎo)致PI3-K下游分子活性下降，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)PI3-K/Akt依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，起到負(fù)調(diào)控作用[15，16]。PIP3是重要的第二信使，通過(guò)PI3K參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生存、黏附和遷移[17,18]。PI3K通路與癌癥發(fā)展密切相關(guān)。因此, 信號(hào)通路的特定位置可能成為抗癌治療的靶點(diǎn)[19]。SHIP2促進(jìn)PIP3脫磷酸生成PIP2,抑制P13K/AKT信號(hào)通路活化,達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。潛在的影響途徑包括PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)[20]、Ras和促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)[21]等。

最近的一項(xiàng)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中SHIP2存在高表達(dá)，它促進(jìn)了細(xì)胞的增殖, 對(duì)小裸鼠針對(duì)性的抑制SHIP2可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19]。此外, 現(xiàn)在臨床中已經(jīng)開始檢測(cè)乳腺癌組織中SHIP2蛋白的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)SHIP2蛋白在乳腺癌組織中的含量比在非乳腺癌組織樣本明顯增高,這表明SHIP2可以作為具有乳腺癌預(yù)后意義的生物標(biāo)志物[11]。這些發(fā)現(xiàn)表明SHIP2可以是癌癥治療策略中一個(gè)新穎的抗癌靶點(diǎn)。因此,我們研究在NSCLC 中SHIP2的表達(dá)與不同臨床及病理參數(shù)的關(guān)系，從而為SHIP2對(duì)NSCLC的預(yù)后影響提供依據(jù)。本研究中,qPCR和IHC的結(jié)果是一致的, 在我們應(yīng)用qPCR檢測(cè)NSCLC組織標(biāo)本中SHIP2 mRNA的表達(dá)中，16例新鮮NSCLC組織中SHIP2 mRNA水平(4.34±0.133)顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織(2.12±0.064) (P<0.05),SHIP2在非小細(xì)胞肺癌樣本的水平比相應(yīng)的癌旁正常組織高出約2.05倍。IHC試驗(yàn)中，SHIP2在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織(P<0.05)。Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)和時(shí)序檢驗(yàn)分析表明SHIP2高表達(dá)、吸煙、晚期腫瘤和預(yù)后不良顯著相關(guān)。表明相比鄰近組織，NSCLC有著更高的SHIP2表達(dá),這表明SHIP2表達(dá)在NSCLC腫瘤發(fā)生中扮演了一個(gè)重要的角色。SHIP2的表達(dá),主要局限在NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì), 和以前在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同[12]。此外,我們發(fā)現(xiàn)SHIP2高表達(dá)與NSCLC臨床病理特征相關(guān)，SHIP2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042), TNM階段(P=0.036),5年生存率(P=0.046)有關(guān)。單變量分析結(jié)果表明,SHIP2表達(dá)、吸煙狀況和TNM階段與NSCLC患者的壽命相關(guān)。多變量分析結(jié)果證明在NSCLC不良預(yù)后因素中， SHIP2高表達(dá)、吸煙和TNM晚期階段是獨(dú)立的預(yù)后因素。生存分析數(shù)據(jù)也符合上述結(jié)論。

綜上所述,SHIP2可以用作NSCLC的預(yù)后生物標(biāo)志物。SHIP2的高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。以后，我們需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明SHIP2參與NSCLC表達(dá)潛在的機(jī)制。

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doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.005

【中圖分類號(hào)】R 734.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)14-2101-04

(收稿日期：2016-01-11)

Expression and significance of SHIP2 in non-small cell lung cancer

ZHANGJian,YUANQi,FUMaoying.

DepartmentofComprehensiveSurgery,TheFirstPeople’sHospitalofKunshanCity,Jiangsu,Kunshan215300,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of SHIP2 in human non-small-cell lung carcinoma (NSCLC),and to explore the correlation between its expression and prognosis of NSCLC.MethodsThe one-step quantitative-PCR (qPCR) and immunohistochemistry (IHC) assay were performed to detect the expression of SHIP2 in NSCLC. The Kaplan-Meierstatistical method and log-rank test were used to evaluate the prognosis of 100 patients with NSCLC.ResultsThe expression levels of SHIP2 RNA and protein in NSCLC were significantly higher than those in corresponding non-cancerous tissues (P<0.05). The expression of SHIP2 in NSCLC was closely correlated to lymph node metastasis, TNM stage, 5-year survival rate (P<0.05). The results by Kaplan-Meierstatistical method and log-rank test showed that the high-expression of SHIP2, smoking and advanced tumor were closely related with unfavourable prognosis of patients with NSCLC.ConclusionSHIP2 expression is correlated to malignant phenotypes of NSCLC,which can be regarded as an important carcinogenic gene and independent prognosis factor of NSCLC.

【Key words】SHIP2；non-small-cell lung carcinoma；PCR；immunohistochemistry；prognosis