宋　輝，趙旭東，季文樾

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110004)

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PKM2在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

宋輝，趙旭東，季文樾△

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110004)

[摘要]目的為了明確喉癌組織中是否有M2型丙酮酸激酶(PKM2) mRNA和蛋白表達，進一步探討喉癌組織中PKM2表達的臨床意義。方法應(yīng)用實時定量熒光PCR(Real-time PCR)和Western blot檢測PKM2在93例喉癌組織和55例癌旁正常組織中的表達。分析PKM2蛋白是否和性別、年齡、細胞分化、腫瘤位置及T分期相關(guān)，以及喉癌組織中PKM2表達和臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果喉癌中PKM2的mRNA表達水平是喉癌旁正常黏膜的4.32倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。喉癌組織中PKM2 mRNA表達水平是喉癌旁正常黏膜的1.74倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同的性別、年齡及腫瘤位置之間的PKM2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T分期Ⅲ期和Ⅳ期及細胞分化為中低分化的病例PKM2蛋白水平分別顯著高于T分期為Ⅱ期及細胞分化為高分化的病例(P<0.05)。結(jié)論PKM2在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的促進作用，可能是治療喉癌的新靶點。

[關(guān)鍵詞]喉腫瘤；丙酮酸激酶；M2型丙酮酸激酶；無氧糖酵解

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身腫瘤的第11位，約占新發(fā)惡性腫瘤的1%。世界的大多數(shù)地區(qū)喉癌的發(fā)病率繼續(xù)呈上升趨勢[1]。喉鱗狀細胞癌占所有喉惡性腫瘤的85%～90%[2]。盡管外科治療和放、化療廣泛地應(yīng)用于喉癌的治療，但是喉癌患者的5年生存率并沒有提高[3]。因此，喉癌的分子生物學機制的研究十分重要，對于確定喉癌治療的新靶點有重要意義。許多腫瘤細胞葡萄糖攝取能力很高但是氧化、磷酸化能力很低。腫瘤的這種在氧氣的存在下持續(xù)大量產(chǎn)生乳酸的過程叫做“有氧糖酵解”。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)在無氧糖酵解的生理過程中起到了關(guān)鍵作用。PK共有5種亞型，其中M2型丙酮酸激酶(PKM2)亞型在腫瘤細胞中比例明顯升高，提示其有可能在腫瘤細胞的有氧糖酵解中起到關(guān)鍵作用。迄今尚少見關(guān)喉鱗狀細胞癌與PKM2相關(guān)性方面的報道，本研究將通過實時定量熒光PCR(Real-time PCR)、Western blot來檢測人喉鱗狀細胞癌中PKM2表達水平并探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料經(jīng)患者知情同意，選擇2011年1月至2013年12月于本院耳鼻喉科93例行手術(shù)的喉鱗狀細胞癌患者，具有其完整臨床資料。其中男87例，女6例；按照病理分級，高分化43例，中分化21例，低分化29例；按照國際抗癌協(xié)會2002年的喉癌分期標準分期，Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期54例。所有標本離體后迅速放入液氮中，-80 ℃深凍冰箱保存。所有上述患者術(shù)前均未接受放、化療，標本為手術(shù)切除1 h內(nèi)獲得的癌組織93例(經(jīng)病理證實為喉鱗狀細胞癌組織)及癌旁正常組織55例(距腫瘤組織至少2.0 cm，病理證實未發(fā)現(xiàn)癌細胞)。

1.2方法

1.2.1主要試劑Trizol試劑、Real-time PCR試劑盒、商品化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物及PKM2引物合成購自大連寶生物公司；PKM2兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶1 000)，購自美國Cell Signaling公司。

1.2.2Real-time PCR 方法檢測PKM2 mRNA

1.2.2.1總RNA提取取-80 ℃深凍冰箱保存喉癌組織標本100 mg，加入1 mL Trizol和喉癌組織混合剪碎，使用勻漿機使樣品充分裂解。再于勻漿后的標本混合液中加入200 uL氯仿，充分振蕩、搖勻后于室溫靜置5 min，直至其完全分層。4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min。提取上述離心后液體的上層無色液體，之后與500 μL異丙醇充分搖晃直至混勻，室溫靜置10 min,4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min。移液器吸除上層無色液體，無水乙醇反復洗滌3次，4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min，移液器吸除上層無色液體，室溫晾干后每個樣品中加入20 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水，使RNA樣品充分溶解后，取1 μL樣品再加79 μL DEPC水進行RNA測定。用分光光度計檢測A260/A280吸光度比值，比值大于1.8為合格。

1.2.2.2Real-time PCR檢測應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(大連寶生物公司)，按照試劑加樣。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，1個循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后取1 μL反應(yīng)生成產(chǎn)物再加入9 μL滅菌蒸餾水，稀釋為原生成物的10倍作為Real-time PCR反應(yīng)的工作液。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系按如下藥品和劑量加樣。5×PrimescriptTMbuffer 2.0 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimescriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，樣品RNA 1.0 μL；合計每個樣品10.0 μL。對93例喉癌及55例癌旁正常組織采用Real-time PCR方法檢測GAPDH及PKM2的表達情況。PKM2引物設(shè)計及合成如下，上游:5′-CGA GCC TCA AGT CAC TCC ACA G-3′；下游:5′-GAT TCC GGG TCA CAG CAA TG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，61 ℃ 20 s，45個循環(huán)；95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s。Real-time PCR反應(yīng)體系按如下藥品和劑量加樣：SYBR premix Ex TaqTM5.0 μL,滅菌蒸餾水 3.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1.0 μL；合計每個樣品10.0 μL。

1.2.2.3Western blot檢測取-80 ℃深凍冰箱保存喉癌組織標本100 mg，組織剪充分剪碎，加入0.6 mL蛋白裂解液,充分混勻。使用勻漿機充分勻漿(注意冰下操作，慎防工作溫度過高使蛋白溶解)，使充分裂解。4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min，離心后，取出沉淀，吸取上層無色透明液體。提取的喉癌組織蛋白樣品應(yīng)用Larry法蛋白定量，并稀釋成3 mg/mL。取稀釋后蛋白樣品0.1 mL，加入5×上樣緩沖液，100 ℃沸水煮5 min后，室溫靜置，-20 ℃冰箱保存。取20 μL蛋白樣品上樣到10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，40 mA恒壓電泳，待溴酚藍進入凝膠底部后，進行蛋白轉(zhuǎn)印，100 V，1.5 h條件下把蛋白質(zhì)再印跡到硝酸纖維素膜上。充分洗膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉硝酸纖維素膜1 h。再次TBST充分洗膜后，用抗PKM2和抗β-actin一抗4 ℃孵育過夜。再次TBST充分洗膜后，堿性磷酸酶標記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。再次洗膜，應(yīng)用ECL顯色劑進行顯色，置于凝膠成像儀成像，灰度值計算蛋白表達相對值。

2結(jié)果

2.1PKM2在喉鱗狀細胞癌中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)喉癌中PKM2 mRNA表達的相對值是4.32±1.97;喉癌旁正常黏膜中PKM2 mRNA表達的相對值是1.00±0.57。喉癌中PKM2 mRNA表達水平是喉癌旁正常黏膜的4.32倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1　Real-time PCR檢測PKM2 mRNA表達水平

2.2PKM2蛋白在喉鱗狀細胞癌中表達上調(diào)喉癌中PKM2 蛋白表達的相對值是71.26±44.12;喉癌旁正常黏膜中PKM2 蛋白表達的相對值是41.03±30.69。喉癌組織中PKM2的蛋白表達水平是喉癌旁正常黏膜的1.74倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

M：正常喉黏膜組織；Ca:喉癌組織。

圖2Western blot檢測PKM2蛋白表達水平

2.3PKM2 mRNA表達和臨床病理學參數(shù)的關(guān)系不同的性別、年齡及腫瘤位置之間的PKM2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T分期Ⅲ期和Ⅳ期的病例PKM2 mRNA水平顯著高于T分期為Ⅱ期的病例(P<0.05)。細胞分化為中低分化的病例PKM2蛋白水平顯著高于細胞分化為高分化的病例(P<0.05)，見表1。

表1　PKM2 mRNA 和臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3討論

目前很多的研究提出了腫瘤細胞可能存在一種新的代謝方式，其命名為有氧糖酵解。有氧糖酵解即在氧氣充足的情況下腫瘤細胞不依靠線粒體進行氧化磷酸化供能，而是通過葡萄糖酵解產(chǎn)生能量，這種現(xiàn)象最早被Warburg發(fā)現(xiàn)并且提出。此后大量研究提示該種供能方式是腫瘤細胞的主要代謝方式之一，該現(xiàn)象被稱作“瓦博格效應(yīng)”(Warburg Effect)[4-5]。大量研究證實了瓦博格效應(yīng)在腫瘤細胞的代謝中提供了大量的增殖使用的能量，為腫瘤細胞的無限制增殖提供了可能[6]。

PK有5種不同的同工酶,分別為L型、R 型、M1型、M2型和腫瘤M2型,這5種同工酶的表達具有組織特異性[7]。腎、小腸、近曲小管和肝臟主要表達L型PK。而R型主要見于紅細胞主。PKM1主要存在于心臟、腦組織和骨骼肌組織。PKM2主要常見于肺、腎臟、胚胎和未分化或增生的組織、成人干細胞及腫瘤組織。以上5種亞型多數(shù)以四聚體形式存在，但是腫瘤細胞中的PKM2多數(shù)是二聚體，其功能表現(xiàn)為腫瘤細胞的特異性高代謝。在腫瘤形成過程中，PK同工酶之間的轉(zhuǎn)化一直在發(fā)生中，例如，腦組織中的PKM1的消失，肝組織中L型PK的消失，同時被PKM2取代[8-19]。由于核酸的高速代謝與合成，腫瘤細胞被分類為核糖基因型和核酸基因型[9,20-21]。PKM2與有氧糖酵解的關(guān)系的研究一直都是腫瘤研究的熱點，Christofk等[21]和Nix等[22]研究發(fā)現(xiàn)PKM2亞型可能是有氧糖酵解的關(guān)鍵酶，在腫瘤的新陳代謝和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。PKM2蛋白表達上調(diào)和丙酮酸mRNA是正相關(guān)的，這些表達是由ras基因及其下游轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導因子-1(HIF-1)、刺激蛋白(SP)1和SP3調(diào)控的[23-25]。PKM2由四聚體分離成二聚體存在的過程與多種腫瘤原癌基因相互作用。人類乳頭狀瘤病毒E7原癌基因和PKM2密切相關(guān)。更有進一步研究提示使腫瘤細胞中的PKM2基因表達沉默，瓦博格效應(yīng)逆轉(zhuǎn)。這提示PKM2蛋白表達是有氧糖酵解所必需的，這種有氧糖酵解的代謝方式使腫瘤具有生長優(yōu)勢[26]。更有研究表明PKM2的二聚體和四聚體之間的相互轉(zhuǎn)換的動態(tài)平衡，是正常細胞增殖的代謝調(diào)節(jié)方式[27-31]。

PKM2蛋白的過表達和口腔癌的不良愈合和臨床病理參數(shù)成正相關(guān)[32]。Shikonin通過抑制PKM2抑制細胞增殖來抑制皮膚癌的發(fā)生、發(fā)展[33]。PKM2在HT29結(jié)腸癌細胞的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵的促進作用,促進了結(jié)腸癌細胞的增生轉(zhuǎn)移[34]。PKM2的過表達和宮頸癌的不良愈合和放療抵抗明顯相關(guān)。

本研究證明了喉鱗狀細胞癌中存在PKM2 mRNA和蛋白的表達。和正常癌旁組織相比，PKM2 mRNA和蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中表達顯著上調(diào)。這提示PKM2 mRNA和蛋白可能在人喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了一定的促進作用。同時本研究證明了不同的性別、年齡及腫瘤位置之間的PKM2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。而T分期Ⅲ期和Ⅳ期的病例PKM2 mRNA水平顯著高于T分期為Ⅱ期的病例；細胞分化為中低分化的病例PKM2蛋白水平顯著高于細胞分化為高分化的病例。這提示PKM2 mRNA和腫瘤的進展和分化程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明PKM2促進喉鱗狀細胞癌的侵襲性和生長，它的高表達可能是喉鱗狀細胞癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子。本研究沒有包括臨床分期Ⅰ期的喉鱗狀細胞癌，因為Ⅰ期的喉鱗狀細胞癌都通過激光手術(shù)治療不能留存標本。對于PKM2在喉癌的代謝及腫瘤進展中的作用機制還需要進一步的研究。

綜上，PKM2可能在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的促進作用，針對PKM2的治療可能成為喉癌治療新的方向。

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作者簡介：宋輝(1970-)，講師，碩士，主要從事喉癌的病因?qū)W研究。 △通訊作者，E-mail:Jiwy@sj-hospital.org。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.016

[中圖分類號]R767.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2080-04

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-02-02)

The expression and clinical significance of PKM2 in laryngeal squamous cell carcinoma

Song Hui，Zhao Xudong，Ji Wenyue△

(OtolaryngologyDepartment，ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity，Shenyang,Liaoning110004，China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression of PKM2 mRNA and protein in laryngeal carcinoma and to further explore the clinical significance of PKM2 expression in laryngeal carcinoma.MethodsWe used Real-time PCR and Western blot to detect the expression of PKM2 in 93 cases of laryngeal carcinoma tissues and 55 cases of adjacent normal tissues.Then we analysed the relationship between PKM2 mRNA and gender,age,cell differentiation,tumor location,T stage in laryngeal carcinoma and the clinical pathological parameters.ResultsThe expression level of PKM2 mRNA in laryngeal carcinoma was 4.32 times higher than that of adjacent normal mucosa,and the difference had statistical significance(P<0.05).The expression level of PKM2 protein in laryngeal carcinoma was 1.74 times higher than that of adjacent normal mucosa,and the difference had statistical significance(P<0.05).There was no statistical significant difference among different gender,age and primary tumor tissue(P>0.05).The expression of PKM2 mRNA in patients of T3,T4 patients and lower pathological differentiation were significant elevated(P<0.05).ConclusionPKM2 might play a certain role in promoting development of the occurrence of laryngeal carcinoma.

[Key words]laryngeal neoplasms；pyruvate kinase；PKM2；anaerobic glycolysis